李洪波， 朱辛明， 宋玉国， 熊 英， 王 萍

病理状态下的血小板黏附、激活、聚集形成的动脉粥样硬化被认为是脑梗死(cerebral infaretion，CI)的重要致病因素之一。活化状态下的血小板膜糖蛋白CD41/CD61复合物能表达多种血小板受体功能，与纤维蛋白原、血管性血友病因子(vWF)、纤维连接蛋白、玻基结合素等粘连性蛋白结合形成异二聚体，在血小板聚集中起着关键作用。本实验采用病例-对照的方法，研究血小板膜糖蛋白CD41/CD61的基因多态性及其表达率，探讨血小板膜糖蛋白CD41/CD61与脑梗死的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

脑梗死组及对照组均来自吉林地区，汉族人。脑梗死组均为我院确诊的脑梗死首发住院患者115例，其中男64例，女51例，年龄36～77岁，平均63±11岁。符合1995年全国第四次脑血管病学术会议制定的脑梗死诊断标准，均经头颅CT或MR证实有相关责任病灶;排除既往脑出血、心肌梗死、冠心病、心脏瓣膜病、糖尿病等病史。对照组103例，均为同期门诊健康体检者，其中男59例，女44例，年龄33～79岁，平均61±10岁。

1.2 标本的采集

两组均于清晨空腹抽取静脉血2ml，所有受试者排除近3个月使用抑制血小板功能药物史。

1.3 CD41/CD61基因多态性分析

1.3.1 DNA 的制备

采取的静脉血标本EDTA-Na2抗凝，-40℃保存备用。根据《分子克隆实验指南》(第3版)中蛋白酶K法提取全血标本DNA，提取试剂盒(离心柱型)购自天根生化科技(北京)有限公司。

1.3.2 聚合酶链反应(PCR)

1.3.2.1 CD41 PCR 扩增 CD41的上游引物5’-CTC AAG GTA AGA GCT GGG TGG AAG AAAGAC-3’，下游引物 5’-CTC ACT ACG AGA ACT GGA TCC TGA AGC CTC-3’。PCR反应总体积为10μl，含 200μmol/L dNTP，上、下游引物各 0.3μl和1μl DNA 模板，0.04μlTaqDNA 酶，反应条件为 95℃预变性7min，按下列程序循环，变性94℃30s，退火58℃30s，引物延伸 72℃15s，共 35 个循环，最后72℃延伸7 min。取2μl PCR产物在2%的琼脂糖凝胶上电泳，全自动凝胶成像系统分析结果。

1.3.2.2 CD61 PCR 扩增 CD61的上游引物5’-CTG CAG GAG GTA GAG AGT CGC CAT AG-3’，下游引物5’-CTC TCT AGA CCT CCA CCT TGT GCT CT-3’，PCR 反应总体积为 10μl，含 200μmol/L dNTP，上、下游引物各 0.3μl和 1μl DNA 模板，0.04μl TaqDNA 酶，反应条件为 95℃ 预变性 7min，按下列程序循环，热变性94℃30s，退火64℃30s，引物延伸72℃15s，共35个循环，最后72℃延伸7min。取2μl PCR产物在2%的琼脂糖凝胶上电泳，全自动凝胶成像系统分析结果。

1.3.3 限制性内切酶酶切

取CD41 PCR扩增产物4μl用内切酶FokⅠ1μl酶切，CD61 PCR扩增产物用内切酶 ScrFⅠ1μl酶切，37℃水浴6h，反应结束后，各取酶切产物10μl，与1.5μl 6×Loading Buffer(DNA 上样缓冲液)混合，应用含EB 的(终浓度1.0μg/ml)2.0%高分辨率琼脂糖凝胶电泳，全自动凝胶成像系统分析结果。

1.4 CD41/CD61表达率检测

采取的静脉血标本6h之内进行检测。使用美国Beckman Coulter公司的流式细胞仪，型号为Epics-XL，每个样本分析 10000个血小板，结果以CD41/CD61阳性细胞的百分率表示。所用试剂均由美国Beckman Coulter公司生产。

1.5 统计学分析应用

应用SPSS 11.5统计学软件进行数据处理，组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CD41基因多态性分布分析

限制性内切酶FokⅠ将PCR产物切成3种形态:aa(切开型)，ab(部分切开型)，bb(未切开型)。脑梗死组的aa型少于对照组，bb型多于对照组，而两组的ab型基本相等。脑梗死组bb基因型频率为41.7%，对照组为23.3%，两组比较有显著性差异(P ＜0.05)(见表1)。

2.2 CD61基因多态性分析

酶切产物琼脂糖凝胶电泳分析均显示为基因型aa(未切开型)。脑梗死组 b等位基因频率为60.4%，对照组为47.6%，两组比较有显著性差异(P ＜0.05)(见表2)。

2.3 两组间CD41/CD61表达率比较

脑梗死组CD41/CD61表达率为96.0% ±8%，对照组为85.5% ±13%，有统计学意义(P＜0.05)(见表3)。

2.4 两组间CD41基因多态性与CD41/CD61表达率比较

脑梗死组CD41 bb基因型CD41/CD61表达率较aa基因型增高明显，差异有显著性(P＜0.05)(见表4)。

表1 两组间CD41基因型分布比较

表2 两组间CD41等位基因比较

表3 两组间CD41/CD61表达率比较

表4 两组间CD41基因多态性与CD41/CD61表达率比较

3 讨论

脑梗死是严重危害人类身体健康的疾病，动脉硬化是其病理学发病基础，尤其是颈部大血管和脑内动脉存在的粥样硬化斑块破裂时，血管内膜损伤激活血小板，血管内皮组织和血液中的其他多种成分也同时被激活。在血小板的参与下，血小板和纤维蛋白原聚集成团，不可逆的形成动脉血栓，进而造成血管栓塞［1，2］。

CD41抗原为整合素的αⅡb链，CD61抗原为β2链，两者共同形成CD41/CD61(GPⅡb/Ⅲa)复合物。现已证实，CD41/CD61复合物是一种杂二聚体整合素，其在胚胎发生、炎症、免疫反应、肿瘤转移及细胞聚集等各个方面起着关键作用。CD41/CD61的分子生物学研究表明基因定位于17q21～q22，位于血小板表面，每个血小板表面大约有5 000个CD41/CD61糖蛋白分子，众多研究证实CD41/CD61与纤维蛋白原等的结合是血小板凝集过程中的最后共同途径。国外有研究表明CD41基因多态性与脑梗死发生有关［3，4］。国内段淏等［5］采用病例对照分析方法，对上海地区221例入选者进行CD41基因多态性分析，结果也表明CD41基因多态性与脑梗死的发生有相关性。Wagner等［6］进行了 CD61基因多态性分析，研究表明，年轻女性缺血性脑卒中与CD61的PlA2多态性无明显相关性;马丽媛［7］、刘彦虹［8］等国内学者也进行了CD61基因多态性的相关研究，认为PlA基因多态性与脑血栓的发生无相关性，他们均认为CD61 PlA基因多态性可能不是中国人缺血性脑卒中重要的危险因素。本实验采用病例对照组方法，应用PCR-RFLP技术检测CD41/CD61基因多态性，结果表明CD41的b等位基因频率脑梗死组较对照组明显增高;CD61基因型两组均为aa型(未切开型)。

近年来，随着识别不同活化血小板膜抗原的单克隆抗体试剂的相继上市，血栓关联性疾病的血小板膜糖蛋白表达分析逐渐成为研究热点，采用流式细胞术检测血小板活化程度，具有快速、敏感、准确、特异等诸多优点。国外最先研究认为，血小板活化时CD41/CD61复合物作为纤维蛋白受体可出现变化，表达率增高［9］，也有人提出检测相关表达率可作为血栓性疾病的预测指标之一［10］，国内相关研究也支持上述观点［11］。我们采用流式细胞术技术，研究结果显示脑梗死组CD41/CD61表达率较对照组增高，有统计学意义(P＜0.05)。同时，本实验还将两组组间按CD41基因型分组检测CD41/CD61表达率，结果脑梗死组CD41 bb基因型CD41/CD61表达率较 aa基因型明显增高，差异显著 (P＜0.05)，研究结果表明 CD41 bb基因影响 CD41/CD61表达率。因此对脑梗死患者进行CD41基因多态性分析结合检测血小板膜糖蛋白CD41/CD61表达率，可作为脑梗死的观察指标之一。但是，脑梗死是多基因、多病因疾病，同时还受到个体差异等多种因素的影响，综合研究多种基因多态性与表达率在脑梗死疾病发生发展中的相互影响及累积效应，显然较个别基因多态性与表达率关系研究意义更大，这都有赖于今后进一步的研究和探索。

［1］Marina K，Alice M，Metallions CI，et al.In vivo platelet activation in ischemic stroke patients［J］.Stroke，2003，34:174-179.

［2］Yip HK，Chen SS，Lin JS，et al.Serial changes in platelet.Activation in patients after ischemic stroke［J］.Stroke，2004，35:1683-1689.

［3］Carlsson LE，Greinacher A，Spitzer C，et al.Polymorphisms of the human platelet antigens HPA-1，HPA-2，HPA-3，and HPA-5 on the platelet receptors for fibrinogen(GPIIb/IIIa)，von Willebrand factor(GPIb/IX)，and collagen(GPIa/IIa)are not correlated with and increased risk for stroke［J］.Stroke，1997，28:1392-1395.

［4］Reiner AP，Kumar PN，Schwartz SM，et al.Genetic variants of platelet glycoprotein receptors and risk of stroke in young women［J］.Stroke，2000，31:1628-1633.

［5］段 淏，孙晓江.血小板糖蛋白Ⅱb基因多肽性与脑梗死的相关性研究［J］.中国老年学杂志，2005，25(8):1001-1003.

［6］Wagner KR，Giles WH，Johnson CJ，et al.Platelet glycoprotein receptorⅢa polymorphism P1A2 and ischemic stroke risk:the Stroke Prevention in Young Women Study［J］.Stroke，1998，29(3):581-585.

［7］马丽媛，赵 勇，王兴宇，等.血小板膜糖蛋白GPⅡb/Ⅲa基因Leu33Pro多态性与缺血性脑卒中的关系［J］.实用医学杂志，2000，16(10):818-819.

［8］刘彦虹，安晶红，牟凤云.血小板膜糖蛋白GPⅢa基因多态性与脑血栓关系的研究［J］.中国血液流变学杂志，2007，17(2):185-187.

［9］Cahill MR，Macey MG，Dawson JR，et al.Platelet surface activation antigen expression at baseline and during elective angioplasty in patients with mild to moderate coronary artery disease［J］.Blood Coagul Fibrinolysis，1996，7:165-168.

［10］Gawaz M，Neumann FJ，Ott I，et al.Role of activation dependent platelet membrane glycoproteins in development of subacute occlusive coronary stent thrombosis［J］.Coron Artery Dis，1997，8:121-128.

［11］陆 锋，张 梅，郭 力.缺血性脑血管疾病患者血小板膜糖蛋白变化及临床意义［J］.中国实用内科杂志，2006，26:817-819.