程筱雯,梁俊波,缪时英,王琳芳

中国医学科学院北京协和医学院 基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室,北京 100005

Nemo样激酶 (nemo-like kinase,NLK)属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。在果蝇、线虫、爪蟾等多种生物中都存在NLK的同源蛋白,其结构存在高度的相似性,显示NLK在进化过程中十分保守[1-4]。研究显示,NLK能够结合并磷酸化一系列转录因子,参与多个信号通路的调节,其中包括与发育过程密切相关的信号途径Wnt和Notch[5-7]等。Kortenjann等[8]研究发现,NLK基因敲除的C57BL/6胎鼠死于妊娠晚期;而129/Sv品系的NLK敲除小鼠虽能存活,但却生长迟缓并伴有显著的神经异常。最新研究表明,NLK参与调节了生物钟的速度和果蝇的复眼转动[9-10]。本课题组前期研究显示,NLK可能与结直肠癌细胞HCT 116的增殖有关,但HCT 116细胞存在质粒难转染、筛选困难、阳性率低等缺点,故笔者采取了利用病毒包装目的基因感染靶细胞筛选稳定单克隆细胞的策略。腺病毒载体具有宿主范围广、高转染效率、高滴度、高表达、包装容量大、安全性好等突出的优势[11-12],本研究旨在通过优化重组腺病毒包装条件构建NLK基因重组的腺病毒载体,筛选供研究所需的稳定单克隆细胞,拟用于进一步研究NLK与细胞增殖的分子机制。

材料和方法

材料和试剂 pAdTrack-CMV-NLK及其突变体质粒由本课题组构建,测序鉴定正确,低代数的HEK293A包装细胞由北京协和医学院刘德培教授惠赠,BJ5183感受态细胞由北京协和医学院方福德教授惠赠,Trans1-T1感受态细胞购自北京Transgene生物技术有限公司;引物……