张辉华，罗艳娜，，谢青梅，马静云，杨承忠，韩小凤，，毕英佐

（1.佛山科学技术学院生命科学院，广东 佛山 528231；2.华南农业大学动物科学院 ，广东 广州 510642）

防御素是一类古老的内源性抗菌多肽，广泛存在于动物体内。自Evans等［1］从鸡与火鸡异嗜性白细胞中发现β-防御素后，已陆续从鸡、鸭、鸵鸟、鹅和企鹅等禽类动物体内分离发现约30个禽β-防御素基因［2-6］。根据Lynn等［7］的建议，国际上对禽防御素命名进行了统一规定，所有禽来源的防御素都命名为AvBDs（Avian beta-defensins）。上传至NCBI GenBank中登记注册的鸭β-防御素基因序列有AvBD2、AvBD6、AvBD9、AvBD10。对鸭 AvBD2的生物学功能研究表明，体外具有抗菌活性与趋化活性［4，8-9］，具有潜在的应用价值。因此，本试验对鸭AvBD2基因进行了克隆、序列分析与比较及在机体各组织器官分布的研究，以期为对其功能及调控表达奠定基础。

1 材料与方法

1.1 载体与受体菌 质粒pMD-18T购自宝生物工程（大连）有限公司；受体菌JM109为华南农业大学家禽基因工程实验室保存。

1.2 工具酶与主要试剂 质粒提取试剂盒和凝胶回收试剂盒为Omega公司产品；Trizol Reagent Kit、AMV、Premix Ex Taq聚合酶为宝生物工程（大连）有限公司产品。

1.3 引物 根据GenBank上发表的鸭AvBD2（登录号：AY641439）及β-actin基因序列和PCR引物的设计原则，并借助计算机软件DNAStar进行辅助分析，设计了4条PCR引物，分别用于进行鸭AvBD2与β-actin基因的扩增。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，序列如下。

Duck2-P1：5′-GAGGGAAGGGACCAAGAAGA-3′；Duck2-P2：5′-GGTTGTAACAGGAAGGAGATT-3′；β-actin-P1：5′-ATGTACCCGGGCATCGCTG-3′；β-actin-P2：5′-TCAGAAGCATTTGCGGTGG-3′

1.4 肝脏总RNA提取 取脾脏组织约0.1g，按Trizol试剂盒说明方法提取总RNA。

1.5 鸭AvBD2基因的RT-PCR扩增 通过二步法进行RT-PCR。反转录反应体系：RNA 1μL，10x RT Buffer 1μL，dNTPs（各10mmol／L）1μL，RNA酶抑制剂0.25μL，Oligo dT-Adapter Primer 0.5 μL，AMV 0.5μL，MgCl22μL，DEPC水补至10 μL。混匀后，30℃反应10min，42℃反应30min，99℃反应5min，5℃冷却5min。……