张亮权，欧阳昀，刘志刚，曹宗喜，闫明菲，王文华，郭泗虎，张桂红

（华南农业大学兽医学院，广东 广州 510642）

戊型肝炎（hepatitis E，HE）是由戊型肝炎病毒（hepatitis E virus，HEV）引起的一种经粪口途径传播的人兽共患病。从1955～1956年在印度新德里［1］第一次HE大暴发至今，HE已广泛分布于亚洲、非洲及中美洲等发展中国家。新疆是我国HE的高发地区，曾在1986～1988年间暴发该病，是世界上一次大规模的流行，共计发病119280例，死亡707例［2］。

1997年Meng等［3］从猪体内分离出1株野生型HEV，发现其与人类的HEV有极高的同源性，并可感染黑猩猩和恒河猴，因此推测猪可能是HEV感染的一个动物宿主。目前研究表明，HEV在猪群中普遍存在，已经被世界卫生组织认定是发展中国家的一个重要公共卫生问题。因此，对猪源戊型肝炎（swHE）诊断方法的研究十分必要。而荧光定量PCR（Real-time PCR）具有快速、灵敏、特异等特点，适用于swHEV的检测，本试验就建立了检测猪群中HEV的荧光定量PCR方法。

1 材料与方法

1.1 病毒与样品来源 猪源戊型肝炎病毒（swHEV），猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、口蹄疫病毒（FMDV）、猪瘟病毒（CSFV）、圆环病毒2型（PCV2）、猪流感病毒（H1、H3亚型SIV）均由本研究室分离保存；16份胆汁样品采集于广东省某兽医院。

1.2 主要试剂和仪器 AMV反转录酶，Ex Taq DNA聚合酶，pMDl8-T载体［宝生物工程（大连）有限公司］；SYBR qPCR MIX（TOYOBO公司）；荧光定量PCR仪（ABI PRISM 7500型）。

1.3 引物的设计和合成 根据GenBank中swHEV ORF2核苷酸序列的保守区域，应用Primer premier 5.0设计了一对引物并由Invitrogen公司合成，预期扩增片段为126bp。上游引物：5′-CAGAATTGATTTCGTCGG-3′；下游引物：5′-TAGCTATACCCTTGTCCTGCTG-3′。

1.4 样品的处理 胆汁样品用灭菌PBS配成10%的悬浮液，4℃～8000r／min离心10min，取上清，-40℃保存。

1.5 病毒RNA的提取与cDNA的合成 按Invitrogen公司TRIzol®Reagent RNA提取试剂盒的使用说明进行总RNA的抽提，用AMV逆转录酶将总RNA逆转录成cDNA，置-20℃保存。……