樊梓鸾，王振宇，2＊，左丽丽，田双起

（1.哈尔滨工业大学 食品科学与工程学院，哈尔滨 150090；2.东北林业大学 林学院，哈尔滨 150040）

大量数据表明，许多慢性病都与过量的自由基产生有关。自由基通常包括活性氧自由基（ROS）和活性氮自由基（RNS）。大多数活性氧产生于细胞的线粒体呼吸链［1］。内源性代谢反应过程中，好氧细胞产生活性氧，如超氧阴离子，过氧化氢（双氧水），羟自由基（OH·），在缺氧条件下，线粒体呼吸链产生一氧化氮（NO），它可以产生活性氮。RNS可以进一步反应生成其他反应基团，例如，丙二醛和4－羟基物，将诱导过多的脂质过氧化。

红豆越橘（Vaccinium vitis－idaea）为杜鹃花科（Ericaceae）越橘属（Vacciniumspp.）常绿小灌木［2］，俗称雅格达，主要分布N52°以北大兴安岭森林中，果实为亮红色，是提取天然色素的重要原料，在越橘的果实和茎叶中含有花色苷、黄酮、萜类等多种活性成分。红豆越橘中最主要的酚类化合物是花色苷，是一种强抗氧化剂，能够抑制脂质过氧化和生物系统的氧化；可以预防和减少炎症、癌细胞增殖的危险［3］。饮食富含花色苷的果汁对冠状心脏病人有益，体外和动物实验表明，花色苷可以有效的改善记忆力［4］。本文采用X－5大孔树脂纯化富集花色苷，并对分离得到的组分进行活性跟踪，分析抗氧化和抗癌细胞增值活性。为开发高纯度花色苷类物质提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

红豆越桔样品于2010年采自大兴安岭加格达奇，－20℃冻存。癌细胞株：结肠癌HT29、卵巢癌Hela、肺癌A549和肝癌HepG－2细胞，由哈尔滨医科大学肿瘤分院提供。

1.2 实验仪器

BS110型电子天平；721型分光光度计，JJ－2型组织粉碎机，FA25高剪切分散乳化机。

1.3 实验方法

1.3.1 红豆越橘提取物制备。用天平称取冻存浆果20kg，加入冷冻的80%丙酮（1∶2w／v）在组织捣碎机中匀浆5min，从捣碎机中取出匀浆，在高速均质机中均质3min，放入抽滤瓶上的布式漏斗中，漏斗上放置滤纸，抽滤瓶接真空泵进行抽滤。收集滤液置于旋转蒸发仪中，在45℃旋转蒸发至浸膏，于－80℃储存，用于后续纯化富集用。

1.3.2 大孔树脂富集纯化红豆越橘花色苷

通过预实验选定大孔吸附树脂X－5富集纯化花色苷，首先进行树脂预处理，装柱上样，静态吸附，用蒸馏水冲洗柱层析，除去糖分及小分子物质，用斐林试剂（斐林试 剂 甲：0.1g／mL NaOH，斐 林 试 剂 乙：0.05g／mL CuSO4）检测残糖量，大约两个柱体积后既无残糖。采用10%～60%乙醇梯度洗脱，洗脱流速2mL／min，每250mL收集一馏分，分别测定多酚含量和抗氧化活性。

1.3.3 样品中多酚含量测定

采用菲林酚比色法检测多酚含量［5］。精密吸取125μL没食子酸标准溶液或浆果提取物，分别置于l0mL试管中，加入0.5mL的蒸馏水，再加入125μL的菲林酚试剂（FCR），样品混合充分，静置6min，加入1.25mL 7%Na2CO3水溶液。用水补足终体积到3mL。90min后在760nm测定蓝色溶液的吸光度。没食子酸作标品，结果用平均值表示［mg没食子酸等同量／l00g鲜重（fresh weight FW）］，±SD三个重复。

1.3.4 ABTS法测定抗氧化能力

配制ABTS自由基工作液。将样品用甲醇配制成一系列浓度，取0.1mL不同浓度的稀释提取液加入1.5mL ABTS自由基工作液，混合，放置6min后，在734nm处测定吸光度［6］。每份样品平行操作3次，计算公式为：

清除率（%）＝［（AContral－ASample）／AContral］×100%

式中：AContral为1.5mL ABTS溶液与0.1mL甲醇混合后的吸光度，ASample为1.5mL ABTS溶液与0.1mL样品混合后的吸光度。

1.3.5 抗细胞增值活性

所有细胞培养基添加10%胎牛血清，50单位／mL青霉素，50μg／mL链霉素，100μg／mL庆大霉素。收集对数生长期的癌细胞，使其浓度在1×104～5×104细胞／每孔，在96孔板上铺板，37℃培养12h后，加入不同浓度的提取物，三次重复。无提取物的培养基作为空白，处理48h，72h后，加入 MTT，4h后，弃去上清液，加入150μL DMSO，在490nm下用酶标仪测定细胞的增殖活性［7］。

1.4 统计分析

用Sigmaplot 10.0分析软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 大孔吸附树脂X－5富集有效组分的确定

对红豆越桔粗提物进行富集，通过预实验选取X－5大孔吸附树脂，采用10%～60%乙醇梯度洗脱，洗脱流速2mL／min，每250mL收集一组馏分，共收集了12个组分，结果如图1所示，组分2、3、4、5具有较高的多酚含量和抗氧化活性，因此将此四种组分分别命名为LB－2、LB－3、LB－4、LB－5，并将其混合组分命名为LB－MIX。

图1 大孔吸附树脂X－5富集分离红豆越橘丙酮提取物，10%～60%乙醇梯度洗脱共收集12个组分

2.2 抗结肠癌HT29细胞增殖活性

将大孔树脂纯化的后的5组样品及阳性对照环磷酰胺，分别作用结肠癌HT29细胞48h和72h后，如图2所示，处理48h后，环磷酰胺和LB－4各剂量组对结肠癌细胞的抑制活性没有 LB－MIX、LB－2、LB－3和 LB－5效果明显。其中LB－MIX在48h后对结肠癌细胞的抑制活性最强，但作用72h后，LB－5对癌细胞的抑制活性最大，细胞只增殖了22.25±5.45%。

图2 红豆越橘初级纯化产物在48h和72h抑制结肠癌HT29细胞增殖活性

2.3 抗肝癌HepG2细胞增殖活性

如图3所示，各组分抑制肝癌细胞HepG2细胞的增殖活性呈现明显的剂量效应关系，随着时间的延长，剂量的增大表现出明显的抑制肝癌细胞活性。48h，LB－MIX对癌细胞的抑制增殖活性达到22.25±5.45%。72h，对癌细胞的抑制增殖活性达到13.64±0.88%。其次为 LB－5、LB－3。LB－2、LB－4和环磷酰胺对癌细胞抑制增殖活性没有达到半数抑制率。

图3 红豆越橘初级纯化产物在48h和72h抑制肝癌HepG2细胞增殖活性

2.4 抗卵巢癌Hela细胞增殖活性

如图4所示，LB－MIX、LB－5、LB－3能够明显的抑制卵巢癌Hela细胞的增殖并随着浓度的增加抑制活性增强，48h，72h后，LB－MIX浓度达到400μg／mL时，其对癌细胞的抑制增殖活性分别达到29.04±3.32%和24.27±3.05%。其次，为LB－5和LB－3。

图4 红豆越橘初级纯化产物在48h和72h抑制卵巢癌Hela细胞增殖活性

2.5 抗肺癌A549细胞增殖活性

图5 红豆越橘初级纯化产物在48h和72h抑制肺癌A549细胞增殖活性

如图5所示，抗癌活性由大到小依次为LB－MIX＞ LB－5＞LB－3＞ LB－2＞ LB－4＞ 环磷酰胺。72h后，LB－MIX抑制A549增殖最有效，其只增殖了12.67±0.37%。

3 结论

红豆越橘粗提物经过大孔树脂X－5纯化后，分部收集最有效地组分，进行抗氧化和抗癌细胞增殖活性分析，结果显示，红豆越橘的总纯化组分的抗癌活性比分部收集的组分还要好，因此选定总纯化组分作为后续的研究对象。

［1］Kouakou－Siransy，G.，Sahpaz，S.，Irie－Nguessan，G.，et al.Oxygen species scavenger activities and phenolic contents of four West African plants［J］.Food Chem，2010，118（2）：430－435.

［2］关丽华，王秀华.红豆越橘中化学成分的研究进展.北方园艺，2007（4）：81－83.

［3］Konic－Ristic，A.，Savikin，K.，Zdunic，G.，Jankovic，T.，Juranic，Z.，Menkovic，N.＆Stankovic，I.Biological activity and chemical composition of different berry juices.Food Chemistry.2011，125（4）：1412－1417.

［4］Lehtonen，H.M.，Rantala，M.，Suomela，J.P.，Viitanen，M.＆Kallio，H.Urinary Excretion of the Main Anthocyanin in Lingonberry （Vaccinium vitis－idaea），Cyanidin 3－O－Galactoside，and Its Metabolites.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2009，57（10）：4447－4451.

［5］Wang，M.，Liu，J.R.，Gao，J.M.，et al.Antioxidant Activity of Tartary Buckwheat Bran Extract and Its Effect on the Lipid Profile of Hyperlipidemic Rats［J］.J Agr Food Chem，2009，57（11）：5106－5112.

［6］Bao，J.S.，Cai，Y.Z.，Sun，M.，et al.Anthocyanins，flavonols，and free radical scavenging activity of Chinese bayberry （Myrica rubra）extracts and their color properties and stability.J Agr Food Chem，2005，53（6）：2327－2332.

［7］Prasad，K.N.，Xie，H.H.，Hao，J.，Yang，B.，Qiu，S.X.，Wei，X.Y.，Chen，F.，＆Jiang，Y.M.（2010）.Antioxidant and anticancer activities of 8－hydroxypsoralen isolated from wampee Clausena lansium （Lour.）Skeels peel.Food Chemistry，118（1）：62－66.