贠可力，王振宇，2＊

（1.哈尔滨工业大学 食品科学与工程学院，哈尔滨 150090；2.东北林业大学 林学院，哈尔滨 150040）

红松（Pinus koraiensis），亦称海松或者果松。常 绿乔木，高达40m。其叶五针一束，长6～12cm。红松种子长1.2～1.6cm，子叶13～16枚。球果卵状圆锥形，种子大而无翅。红松是我国东北地区重要的松属树种，分布于我国东北长白山至小兴安岭地区，常与红皮云杉及鱼鳞松等组成混交林。耐旱性强，喜微酸性或中性土壤，针叶及球果中含有抗氧化活性成分，种子可食，入药后具有祛风除湿、滋养补虚轻身延年的功效。近年来，天然抗氧化剂的研究受到广泛关注，其中多酚类是主要的抗氧化活性成分之一。自由基引起的疾病有80多种，因而自由基清除剂对于人类健康有重要意义。

1 材料与方法

1.1 实验材料

红松树皮于2009年得自伊春林业局林区附近的木材加工厂的废弃树皮。

1.2 实验仪器

高速万能粉碎机，电子天平，恒温水浴锅，北京医疗电子仪器厂。T6新世纪紫外分光光度计，电热恒温水浴锅，GL－16G－C型高速冷冻离心机，DF－110型电子分析天平。精密pH计，R－205B旋转蒸发仪，KQ－5200超声波仪。

1.3 试验试剂

没食子酸，Folin酚试剂，无水碳酸钠，无水乙醇，浓硫酸，盐酸均为分析纯。三羟甲基氨基甲烷（Tris碱）（Sigma公司）、1，1－二苯基苦基苯肼（DPPH）（Aldrich公司）；抗坏血酸、硫酸亚铁 （FeSO4）、邻二氮菲、2－硫代巴比妥酸 （TBA）、30%过氧化氢、三氯乙酸 （TCA）、邻苯三酚、铁氰化钾K3Fe（CN）6、没食子酸、福林试剂、碳酸钠、浓盐酸、磷酸一氢钠、磷酸氢二钠均为国产分析纯。

1.4 实验方法

1.4.1 红松多酚提取方法

将红松树树皮用告诉组织到随机捣碎，过60目筛，用电子天平称取松树皮粉末100g，加入2000mL冷冻的60%丙酮（1∶20w／v），在超声功率为100%，超声温度为50℃条件下提取40min，，在转速为3500r／min下离心6min，滤纸放在抽滤瓶上抽滤，以上过程重复4次。收集滤液置于旋转蒸发仪中，在45℃旋转蒸发至约15%的提取液，将其转移至容量瓶，用去离子水调节到终体积为400mL，制备10份样品，分别取出l0mL混匀作为一份混合样品，于－80℃储存，用于后续抗氧化和抗辐射试验。

1.4.2 多酚标准曲线的制作

采用Folin－ciocalteu比色法检测多酚含量并做了一些修改［1］。用1mL的蒸馏水溶解0.05g没食子酸，定容至10mL，分别移取0、0.1、0.2、0.3、0.5、0.7mL到10mL的试管中，定容。从上述不同浓度的标准液中分别移取0.1mL到10mL的试管中，分别加入6mL水，混合后加入0.5mL Folin－ciocalteu试剂混合，在0.5～8min内加入1.5mL的20%碳酸钠溶液，用水定容，将上述标准溶液在20℃放置2h后，在波长765nm下测定吸光值，绘制标准曲线。

1.4.3 多酚含量的测定

准确称取提取液0.1mL于10mL试管中，按照上述标准曲线测定方法在765nm下测定其吸光值，从上述标准曲线计算相应的总多酚含量，按照以下公式换算总酚含量（以没食子酸得当量值表示）。按上述步骤操作，吸光度为Y轴，浓度为x轴绘制标准曲线，单位是：“mg没食子酸等同量／mL”。按检测流程操作，读取样品的吸光度值，带入回归方程计算样品待测液中总多酚含量。每100g样品中总多酚含量按下式计算：X＝m1v2／mv1×100。

综上可见，敦煌文献数据库的建设随着计算机技术和数字化技术的发展而方兴未艾，但已取得了显著的成绩，在文献保护和研究方面做出了巨大贡献。但通过调研也发现，敦煌数据库的建设尚缺乏系统理论语言学原则指导下建立的、面向敦煌文献语言文字研究而创建的深加工研究型语料库。现有的敦煌文献电子化、数字化工作取得的显著成果，为建设这种深加工多模态语料库提供了有利条件。

式中：X－样品中总多酚含量：m1－根据标准曲线或回归方程计算出待测液中总多酚的含量；m－样品质量：v1－样品提取液测定用体积；v2－样品提取液总体积。

标准曲线的检测结果（见图1）

图1 没食子酸标准曲线

以吸光度A（y）值为纵坐标，浓度（x，μg／mL）为横坐标，用最小二乘法进行线性回归，得到回归方程：y＝0.17569x－0.0025，其中x单位为μg／mL，R2＝0.99977

最后测定的多酚含量为：从100g树皮中共获得了166.32mg总多酚，相当于松树皮中含量为1.663mg／g。

1.4.2 单花青素含量分析测定

单节花青素含量用pH示差分光光度法。提取物用0.025M，pH1的氯化钾缓冲液以1∶3或1∶8的提取物与缓冲液比例混合，在515nm和700nm处测定吸光度，以蒸馏水为空白比色。提取物用pH4.5乙酸钠缓冲液混合，这些溶液在同样的波长下测定。花青素的含量用下式计算。总单花青素（mg／100g鲜果皮）＝A×MW×1000（E×C）。

式中 A：吸光率（A515－ A700）pH 1.0－ （A515－ A700）pH 4.5；MW：449.2花色苷3－糖配基的分子量；E：26900花色苷3－糖配基的摩尔吸光率；C：每毫升每毫克缓冲溶液的浓度。每100g鲜果皮中花色苷的含量用花色苷3－糖配基的毫克数表示。红松树皮中单花青素含量测定结果：164.22mg／100g树皮。

1.4.4 清除 DPPH 自由基试验［2］

（1）准确称取0.1g粗提取物与各个浓度的乙醇洗脱物，分别用95%、50%的乙醇在超声条件下帮助溶解，制成1mg／mL 的母液，分别吸取10、20、40、80、160、320、640μL，用50% 的乙醇溶液定容至5mL，分别加入500μL 0.375mmol／L的DPPH溶液，在水25℃水浴中20min，在517nm下测定吸光值Ai。

（2）分别吸取10、20、40、80、160、320、640μL，用50% 的乙醇溶液定容至2mL，在水25℃水浴中20min，在517nm下测定吸光值Aj。

（3）吸取0.5mLDPPH 溶液，加入2.5mL 50% 的乙醇溶液，在水25℃水浴中20min，测定在517nm下测定吸光值Ao。

1.4.5 清除 ABTS自由基试验［3］

将7mmol／L ABTS和2.45mmol／L的过硫酸钾（终浓度）混合，在室温避光条件下静置过夜，将生成的ABTS溶液用水稀释，使其在30℃，734nm波长下的吸光度为0.7±0.02，即得到ABTS工作液。分别吸取5、10、20、40、80、160μL的浓度为2mg／mL的大孔树脂富集的20%～60%乙醇洗脱物于10mL比色管中，用50%乙醇定容至200μL。再加入1.5mL的ABTS溶液，空白管用蒸馏水代替提取液，对照管用蒸馏水代替ABTS工作液，并做重复试验，室温避光放置1h，于波长734nm下测定其吸光度。并用VC作对照。ABTS自由基清除率（%）＝［A空白－（A样品－A对照）］／A空白×100%。

2 结果与分析

2.1 洗脱物质对DPPH自由基的清除作用

图2 分级洗脱物质的DPPH清除作用

不同洗脱物对DPPH都具有清除作用，其作用在低浓度条件下呈现出很好的计量反应关系，几乎为线性，但当浓度上升至125μg／mL时，清除曲线趋于平缓，说明随着各种洗脱物质的浓度增加对于清除此种自由基的能力量效关系不再明显。其结果如图2。

2.2 洗脱物质对DPPH自由基的清除作用

不同洗脱物对DPPH都具有清除作用，其作用在低浓度条件下呈现出很好的计量反应关系，几乎为线性，但当浓度上升至40μg／mL时，清除曲线趋于平缓，说明随着各种洗脱物质的浓度增加对于清除此种自由基的能力量效关系不再明显。清除效果最好的时40%乙醇洗脱物。其结果如图3。

图3 分级洗脱物质的ABTS清除作用

3 结论

由这些结果可以看出，大孔树脂富集物不同浓度洗脱物对于两种稳定的非生理性自由基由显著的清除作用，有待于进一步研究其机制。

［1］Jie Sun，Yi－Fang Chu，Xianzhong Wu，et al.Antioxidant and Antiproliferative Activities of Common Fruits［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2002，50（25）：7449－7454.

［2］Chanjirakul K，Wang SY，Wang CY，et al.Natural volatile treatments increase free－radical scavenging capacity of strawberries and blackberries［J］.Journal of the Science of Food and Agricultural，2007，87（8）：1463－1472.

［3］Re，R.，Pellegrini，N.，Proteggente，A.，et al.Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay［J］.Free Radical Biology and Medicine，1998，72：1231－1237.