张开刚，张月东，王 玫

脂肪干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）是近年来发现的一种成体干细胞，2001年Zuk等[1]首次从人的脂肪组织悬液中分离出类似于骨髓间充质干细胞，可以在体外稳定增殖，具有多向分化潜能的脂肪干细胞。因具有来源丰富、取材方便、对机体的损伤小、增殖快、能多向分化等优点，迅速成为组织工程学、再生医学等领域的研究热点。本实验通过分离培养兔脂肪干细胞，研究其成骨分化能力，探讨其作为骨组织工程种子细胞的可行性。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂和仪器 Ⅰ型胶原酶、胰蛋白酶、地塞米松、维生素C、β-甘油磷酸钠（sigma公司，美国）；高糖DMEM（Gibco公司，美国）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）染 色 试 剂 盒 、EDTA、四环素（华美生物工程公司）；茜素红（Amersco公司，美国）；恒温CO2培养箱（Queue Systems公司，美国）；病理切片机（leica公司，德国）。

1.1.2 实验动物 4月龄体重为2.0～2.5 kg的健康新西兰大白兔，雌雄不拘，泰山医学院实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK（鲁）2005-0005。

1.2 方法

1.2.1 ADSCs的分离、培养及传代 4月龄健康新西兰大白兔，经耳缘静脉注射空气栓塞致死，取兔双侧腹股沟脂肪，PBS液冲洗剪碎，Ⅰ型胶原酶法消化，加入高糖DMEM培养液重悬浮，恒温CO2培养箱内培养，隔日换液，融合达90%～95%后倾倒原培养液，PBS液轻缓漂洗贴壁细胞2次，尽量洗去残余血清，弃PBS液。在培养瓶中加入适量消化液（0.20%胰蛋白酶+0.02%EDTA）消化，吸管吸取培养液，反复轻柔吹打培养瓶底壁，使已消化的细胞脱离瓶壁，吹打液1200 r/min离心10 min，弃上清。用培养液将沉积细胞重新悬浮，接种于25 cm2培养瓶中，传代比例为1∶2，倒置相差显微镜下观察细胞形态特征及传代情况。……