王英,黄复生,张锡林,徐文岳,段建华

(第三军医大学基础部病原生物学教研室,重庆 400038)

明确某一分子在机体中不同组织的表达、分布及转录水平,对该蛋白的功能研究具有重要提示意义。昆虫能够通过其天然免疫机制防御病原体的入侵感染,其免疫系统包括物理屏障作用、细胞免疫反应和体液免疫反应等。其中,丝氨酸蛋白酶级联反应能够调节昆虫的各种免疫反应,尤其在昆虫抗入侵病原体的黑化包被反应中起着关键作用[1]。丝氨酸蛋白酶能够催化无活性的PPO蛋白水解成有活性的PO,进而启动黑色素的产生和沉积,同时促进伤口愈合和包被反应的发生[2,3]。丝氨酸蛋白酶还参与了细胞吞噬作用,因为利用PPO抗体或PAPs抗体能够明显阻断对细菌的细胞吞噬作用;而分裂素活化蛋白激酶能够通过调节PAPs的分泌控制黑化包被反应和细胞吞噬作用[4]。本研究利用 RTPCR技术和Real-time PCR技术,从mRNA水平研究了丝氨酸蛋白酶3(AdSP3)在大劣按蚊不同组织中的分布及表达水平与疟原虫感染的相关性,推测该酶在大劣按蚊抗约氏疟原虫感染中的生物学作用。

1 材料与方法

1.1 材料

大劣按蚊(Anopheles dirus)为我国海南株,约氏疟原虫(Plasmodium yoelii)为BY265株,感染所用小鼠为昆明株小鼠。

1.2 主要试剂

DEPC购自Sigma公司,琼脂糖购自OXOID公司,溴化乙锭和T ripure RNA提取液购自 Roch公司,RT-PCR试剂盒、DNA Marker及DNA胶纯化回收试剂盒购自 Takara公司,Taq酶购自Promega公司,SYBR Green I购自天泽基因公司。

2 方法

2.1 PCR方法对蚊体内丝氨酸蛋白酶的表达进行组织定位

2.1.1 标本采集及总RNA的提取 取正常4日龄大劣按蚊雌性成蚊200只,采用挤压法(方法同前)将血淋巴细胞收集入1ml Tripure RNA提取液中,用微量加样器枪头吸打数次。……