王艳艳,张健,徐文岳,段建华,黄复生

(第三军医大学基础部病原生物学教研室,重庆 400038)

疟疾是世界上危害最为严重的三大传染病之一,疟疾危及世界人口的40%。该病每年感染1亿多人并造成80多万人死亡(WH0,2009)。在我国疟疾也影响和威胁着人们的健康,尤其是近年来全国发生输入性疟的地区呈逐年增加。目前的抗疟药主要着眼于对疟原虫的作用及其机制研究,极少关注抗疟药能否影响蚊期免疫并抑制或促进蚊体内疟原虫的发育。在疟疾流行地区,青蒿素联合药物已经作为杀红内期第一线药物治疗疟疾患者[1],其中蒿甲醚应用比较广泛。蒿甲醚是否会通过类似调节哺乳动物的方式调解按蚊的免疫反应,从而影响疟原虫在蚊期的发育[2-4]。如果抗疟药在发挥疟疾治疗和预防作用的前提下,又能阻断按蚊传播疟原虫,从控制传染源这一环节切断、控制传播途径,将不失为一种理想的防治手段。

利用斯氏按蚊-约氏疟原虫模型,通过饲喂蒿甲醚糖水的方法,观察蒿甲醚是否能够影响约氏疟原虫在斯氏按蚊体内的发育。通过 RT-PCR分析 NOS、TEP1和 PPO三个斯氏按蚊重要的免疫反应相关基因的表达变化,不仅为这些药物现场使用提供参考依据,而且可能为将来控制疟疾媒介传播提供了新思路。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

斯氏按蚊(Anophelesstephensi)(为我室长期繁殖、饲养的Hor株);约氏疟原虫(Plasmodium yoelii)(BY265株);小鼠(昆明株小鼠由本校实验动物中心提供,体重16～20 g)。

1.2 蒿甲醚对约氏疟原虫在斯氏按蚊体内发育的影响

1.2.1 蚊媒分组 将3-5日龄雌斯氏按蚊分为:感染疟原虫给蒿甲醚组(H):按常规腹腔接种健康小鼠,3 d后,选择4只含有一定数量配子体的小鼠为供血鼠,供大劣按蚊吸血约2 h,将饱血雌蚊移出,感染后24 h,给632 ng/ml[5]蒿甲醚糖水1 d,常规饲养;感染疟原虫组(G):按常规腹腔接种健康小鼠,3 d后,选择4只含有一定数量配子体的小鼠为供血鼠,供大劣按蚊吸血约2 h,将饱血雌蚊移出,常规饲养;吸正常血给蒿甲醚组(Hz):大劣按蚊吸正常小鼠血约2 h,将饱血雌蚊移出,感染后24 h,给637 ng/ml蒿甲醚糖水1d,常规饲养;吸正常血未给药组(Z):大劣按蚊吸正常小鼠血约2 h,将饱血雌蚊移出,常规饲养。

1.2.2 蚊胃感染情况 感染后7 d,两组解剖25-26只斯氏按蚊,在显微镜下观察卵囊发育情况。

1.2.3 统计分析 采用GraphPad Prism 5 Portable软件(V5.00)进行数据处理,应用t检验法进行统计学分析。

1.3 RT-PCR检测给蒿甲醚后24 h,对斯氏按蚊中肠4个免疫基因在疟原虫感染条件下的变化

1.3.1 蚊胃总RNA的提取 感染后2 d,4组分别乙醚25支雌斯氏按蚊,在解剖显微镜下解剖蚊胃,将蚊胃置于冰预冷的匀浆器(氯仿处理)内,加入1 ml T ripure充分冰浴研磨,将裂解液置于氯仿处理的1.5 ml的 EP管内;剧烈震荡5 min,室温放置5 min,使样本充分裂解。加入0.2 ml氯仿,剧烈振荡15 sec,室温静置10 min;4℃12 000 g离心15 min,小心吸取无色上清移至新管,不要触及蛋白层,加入0.5 ml异丙醇,室温静置5～10 min;4℃ 12 000 g离心10 min,去上清,沉淀加入 1 ml 75%乙醇;4℃ 7 500 g离心5 min洗涤沉淀,去上清,空气风干;用适量的DEPC水溶解总RNA,测定总RNA的纯度和浓度;-70℃冰箱保存备用。

1.3.2 离心法收集斯氏按蚊血淋巴和总RNA的提取 感染后2 d,4组分别冷冻麻醉100支雌斯氏按蚊,在解剖显微镜下用解剖针撕开腹部后两节,将蚊虫置于冰预冷、管盖和管底部已用18号针头打了孔的0.5 ml EP管中,每管25只雌斯氏按蚊,然后将0.5 ml EP管放入含100 μ L T ripure的1.5 Ml EP管中,4℃375×g离心10 min。按照试剂盒说明提取斯氏按蚊血淋巴总RNA(同1.3.1)。

1.3.3 逆转录合成cDNA 在0.5 ml EP管中加入以下试剂:5 ×PrimeScriptTMBuffer,2 μ l;Oligo dT Primer,0.5 μ l;Ramdom 6mers,0.5 μ l;PrimeScriptTMRT Enzyme Mix I,0.5 μ l;总 RNA,700 μ g;RNase Free dH2O 补足至 10 μ l,混匀后,37℃,30 min,85℃,5 sec。

1.3.4 引物设计 根据斯氏按蚊AsNOS、AsTEP1和As-PPO序列和斯氏按蚊核糖蛋白S7(AsS7)序列(GeneBank accession number:AY583529、 AF53991、 EF076041、AF062034)。AsTEP1 特异 引物 F:5′-CCTCCCACAGACCAAACGA-3′,AsTEP1 特异 引物 F:5′-ATCGGT TCCGCCAACAAG-3′;AsPPO 特 异 引 物 F:5′-TGTTCCCCGACTCGTTTGT-3′,AsPPO 特异引 物 F:5′-CCCGTGATAGTTGCCGTAG-3′;AsNOS 特 异 引 物 F:5′-CATGCGTGGTAGTGGCGTTGC-3′,AsNOS 特 异 引 物 F:5′-GGCGTGATGAT TGGCTTCTGG-3′;AdS7 特异引物 F:5′-CTAACGACACGAAGACCACAAGA-3′,AdS7 特 异 引 物R:5′-CAACCTGCAACGAAGCAAAA-3′,引 物由 上海 英 骏生物技术有限公司合成。

1.3.5 PCR反应 分别在0.5 ml EP管中按下表建立PCR反应体系 :cDNA 模板 ,1 μ l;引物 F(10 pmol/μ l),0.5 μ l;引物 R(10 pmol/μ l),0.5 μ l;2.5 mM dNTPs,1 μ l;5×PCR buffer,5 μ l;GoTaq,0.25 μ l;ddH2O,18.75 μ l总体积 25 μ l。PCR反应条件:斯氏按蚊S7,反应条件:95℃2 min;95℃40 sec,45℃40 sec,72℃40 sec,27个循环;72℃5 min;AsTEP1条件:95℃2 min;95℃40 sec,50℃40 sec,72℃40 sec,30个循环;72℃5 min;AsPPO条件:95℃2 min;95℃40 sec,55℃40 sec,72℃40 sec,30个循环;72℃5 min;AsNOS条件:95℃2 min;95℃40 sec,53℃40 sec,72℃40 sec,30个循环;72℃5 min。

1.3.6 电泳分析 配制1×TAE电泳缓冲液和1.0%琼脂糖凝胶50 ml,取5μ l PCR反应物加入点样孔内,100V电泳20 min,电泳完毕照相保存。

2 结果

2.1 蒿甲醚对约氏疟原虫在斯氏按蚊体内发育的影响

图1显示疟原虫感染后7 d蚊胃,图1-A显示了感染疟原虫7 d,正常感染组按蚊蚊胃卵囊发育情况;图1-B显示感染给蒿甲醚组按蚊蚊胃卵囊发育情况,两组比较给蒿甲醚组蚊胃中卵囊发育情况明显优于正常感染组卵囊发育;如图1-C所示,感染组斯氏按蚊(26只)蚊胃平均感染度为 44.0,蒿甲醚感染组斯氏按蚊(25只)蚊胃平均感染度为171.5,显示感染给蒿甲醚组按蚊感染度明显高于正常感染组(P＜0.0001),卵囊数量增加3-5倍,说明蒿甲醚可以有效地促进约氏疟原虫在斯氏按蚊体内的发育。

图1 感染后7 d,斯氏按蚊蚊胃BY265疟原虫株卵囊发育情况及感染度(100×)Fig.1 7d post infection,the infection of Anopheles stephensi infected BY265 Plasmodium yoelii(100×)

图2 斯氏按蚊NOS,TEP1和PPO cDNA转录变化Fig.2 TranscriptvariationofAsNOS,AsTEP1and AsPPO cDNA

2.2 RT-PCR检测给蒿甲醚24 h后,斯氏按蚊 NOS、TEP1和PPO3个免疫基因转录变化

蒿甲醚对四组斯氏按蚊3个NOS、TEP1和PPO免疫基因表达影响,半定量PCR检测如图2所示:通过对Z组和Hz组按蚊NOS、TEP1和PPO 3个免疫相关基因的条带亮度比较,显示Hz组的3个基因的条带亮度明显暗于Z组的基因条带亮度,说明在无疟原虫感染条件下,蒿甲醚明显抑制按蚊NOS基因的表达;通过对G组和H组按蚊NOS、T EP1和PP 3个基因的条带亮度比较,显示H组的3个基因的条带亮度明显弱于G组的基因条带亮度,说明在疟原虫感染条件下,蒿甲醚也会明显抑制斯氏按蚊NOS、TEP1和PPO基因的表达,提示蒿甲醚可以下调按蚊免疫基因的表达,抑制其免疫系统,降低按蚊对外界病原生物的抵抗力。

3 讨论

在疟疾流行地区,青蒿素联合药物已经作为第一线杀红内期抗疟药物,其中蒿甲醚应用比较广泛[1,5]。蒿甲醚为青蒿素的衍生物,对疟原虫红内期有强大且快速的杀灭作用,能迅速控制临床发作及症状。本实验结果显示蒿甲醚与氯喹一样可以促进疟原虫在按蚊体内的发育,使卵囊数量增加3-5倍,并通过调节免疫基因的表达,从而影响按蚊免疫反应。蒿甲醚是通过下调 NOS、TEP1和PPO转录水平,发挥了其抑制按蚊免疫系统的作用。而氯喹则是通过下调Sp14D2、AgSP24D、ISPL5、1644280 丝氨酸蛋白酶和 gambicin、defensin and cecropin抗菌肽的表达,影响按蚊的丝氨酸蛋白酶级联反应和抗菌肽的合成,降低按蚊免疫反应,促进疟原虫在蚊体内的发育[7,8]。

疟原虫感染可以按蚊激活insulin-responsive PI3-K/Akt和DSOR1/ERK信号通路,诱导NOS基因的表达上调,使NO产物量增加对疟原虫产生杀伤作用,抑制疟原虫在按蚊体内的发育[4]。蒿甲醚可能是通过抑制insulin-responsive PI3-K/Akt和DSOR1/ERK信号通路,下调NOS基因的表达,抑制NO合成[4,5],致使斯氏按蚊对疟原虫免疫反应减弱,促进疟原虫在按蚊体内更好的发育。PPO是黑化包被反应中重要的效应分子[8-11]。蒿甲醚可以下调PPO基因的表达,蒿甲醚可能是通过抑制丝氨酸蛋白级联反应,下调PPO基因的表达,抑制黑化包被反应,降低斯氏按蚊对疟原虫的防御反应,促进疟原虫在斯氏按蚊体内的发育。

TEP1与哺乳动物的补体因子C3、C4以及α巨球蛋白(α2-Ms)都具有高度的同源性[12]。TEP1不但参与了机体对疟原虫的识别,还能对疟原虫有直接杀伤作用,作为补体样因子,可以识别并结合疟原虫,与LRIM1和APL1共价结合形成类似膜攻击复合物直接杀死疟原虫[14,15],NF-kB依赖的信号通路可以调节免疫关键因子TEP1的表达[14]。蒿甲醚可以下调T EP1的表达,这可能是通过抑制NF-kB依赖信号通路,下调了TEP1的表达,间接降低其对疟原虫的识别杀伤作用,促进疟原虫的发育。

蒿甲醚作为青蒿素的衍生物,广泛应用于临床和现场杀红内期药物治疗,非常有效。我们通过鼠疟模型,根据生物等效设计、临床或者现场使用剂量血药高峰值换算给予按蚊吸饲的蒿甲醚剂量,观察其对蚊期疟原虫发育的影响。研究结果提示蒿甲醚可以促进蚊期疟原虫的发育,提示我们流行区里接受蒿甲醚治疗的病人感染力非常高,按蚊叮刺蒿甲醚治疗的病人血后将会大大增加疟疾传播的几率,有利于疟疾的流行和扩散。这对如何控制疟疾流行、媒介传播提出了新的问题,也为如何合理使用青蒿素类杀红内期药物提出了新的研究课题。除了联合用药多种配方避免或延缓青蒿素类药物产生抗药性外,还要考虑如何降低疟原虫对媒介的易感性,阻断其传播。

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