王燕 褚汉启 周良强 陈金 李志勇 刘云 张平 王春芳 黄孝文 崔永华

1 华中科技大学同济医学院附属同济医院耳鼻咽喉头颈外科(武汉430030);△现在武汉市妇幼儿童保健中心(武汉市儿童医院)耳鼻咽喉头颈外科

研究表明血管纹区域是转运K+进入内淋巴和产生耳蜗内电位的重要部位[1,2],其中最主要的功能活性细胞边缘细胞(marginal cell,MC)是内淋巴产生和调节的关键,并参与了蜗内电位的形成和维持。KCNQ1为近年研究发现的分布于血管纹边缘细胞膜上的三种转运K+的通道蛋白之一[1～3],已发现该通道蛋白功能异常与多种心律失常、遗传性聋等疾病的发生有关[4],其在耳蜗内主要分布于边缘细胞,除参与并维持耳蜗K+循环的作用外[5],亦可认为是边缘细胞的特异性标志蛋白。由于内耳结构复杂及血管纹边缘细胞包裹于骨性蜗壳中,取材困难,所以边缘细胞在内耳听力相关性疾病中的病理生理作用尚不清楚。本实验采用原代消化培养方法,建立成年小鼠血管纹边缘细胞体外分离培养体系,为进一步研究成年期边缘细胞的生理特性、病理生理功能以及相关通道蛋白在耳蜗内电位(endocochlear potential,EP)形成及K+循环中的作用和地位提供基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物 出生75±3 d的健康C57BL/6J小鼠6只,体重30～35 g,雌雄不限,购自华中科技大学同济医学院实验动物中心。

1.2 实验试剂 MEM培养基(Hyclone)中加入15%胎牛血清(Gibco)、氢化可的松0.4 mg/L(Sigma)、表皮生长因子10 ng/ml(Chenkon)、0.02%EDTA 、0.25%胰蛋白酶(Gibco)、胶原酶Ⅱ(invitrogen)。多聚赖氨酸(Sigma),兔抗小鼠角蛋白18(CK18)单克隆抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司),兔抗小鼠KCNQ1多克隆抗体(Santa Cruz),羊抗兔IgG(SABC-cy3)试剂盒,羊抗兔IgG(SABC-FITC)试剂盒(武汉博士德)。……