张延平 张晓强 刘雅丽 黄玮 孙玉蕊

1 中国人民解放军第309医院耳鼻喉科(北京 100091); 2 河南省医学情报研究所; 3 河南省卫生厅

GJB2基因编码缝隙连接蛋白26(connxin 26,Cx26),该基因突变是导致非综合征型聋(nonsyndromic sensorineural hearing impairment,NSHI)的主要原因。目前GJB2基因突变导致耳聋的机制还不完全清楚。内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)是否参与了其致聋过程目前未见报道。GRP78/Bip即葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein,GRP78),又名免疫球蛋白重链结合蛋白(the immunoglobulin heavy chain binding protein,Bip),是一种内质网分子伴侣,在ERS出现时其表达上调,被认为是ERS的特异性标志物之一[1]。为了探讨ERS与NSHI的发病是否有关,本研究检测了不同发育阶段GJB2基因条件敲除小鼠耳蜗组织中GRP78/Bip表达水平,为进一步研究NSHI的致病机理提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 GJB2基因条件敲除小鼠cCx26loxp/loxp;Pax2 Cre/+(cCx26)(实验组,6只)由转基因小鼠Cx26loxp/loxp与 Cx26loxp/-;Pax2 Cre/+小鼠(均由美国Emory大学林曦教授实验室提供)杂交获得,野生型BALB/c小鼠(6只)作为正常对照组。动物统一编号,统一喂养,双盲法测定,两组分别选取P8、P12和P21三个发育阶段各小鼠2只进行实验。

1.2 实验方法 试剂分别为磷酸盐缓冲液(PBS,Merk,德国)、多聚甲醛(Merk,德国)、T riton X-100(Sigma,美国)、羊抗鼠 GRP78多克隆抗体(Santa Cruz,美国)、罗丹明抗羊二抗(Jackson,美国)、含DAPI的封片剂(Invitrogen,美国)、解剖显微镜(Olympus,日本)、冰冻切片机(樱花,日本)、激光共聚焦显微镜(LSM 510,Zeiss,Jena,德国)等。

1.2.1 耳蜗切片 动物戊巴比妥腹腔注射麻醉后,剪开胸骨,暴露心脏进行心脏灌注,断头取耳蜗,在解剖显微镜下,用分离针把蜗尖挑开一小孔,挑破圆窗膜,取出镫骨,用细玻璃吸管将4%多聚甲醛由蜗尖小孔灌注,使固定液经前庭阶、鼓阶从前庭窗和圆窗流出,然后把标本放入该固定液里4℃冰箱内固定过夜。……