刘 璐，李 琳，闵 军，王 捷，伍 衡，曾育杰，陈 双，褚忠华△

(中山大学孙逸仙纪念医院1胃肠外科，2妇产科，3肝胆外科，广东 广州 510120)

肿瘤坏死因子受体相关因子(tumor necrosis factor－receptor associated factor，TRAF)是肿瘤坏死因子超家族和Toll样/白细胞介素－1受体(interleukin－1 receptor，IL－1R)超家族重要的接头分子，在天然免疫和获得性免疫中发挥了重要的作用[1]。作为细胞质中重要接头分子，TRAF6是TRAF家族中唯一能与IL－1R相关激酶、CD40等直接结合的信号分子。上述细胞因子通过TRAF6介导，调节下游信号通路，进而调节细胞的增殖及凋亡[2]。最近研究发现，TRAF6是介导树突状细胞(dendritic cells，DCs)成熟信号转导，促进DCs发育、激活与成熟的关键因子[3]。本实验通过观察TRAF6在不同成熟程度DCs的表达，进一步研究TRAF6在DCs诱导T细胞免疫中的作用。

材料和方法

1 材料

1.1 主要试剂 RPMI－1640干粉、L－glutamine、青霉素－链霉素(P－S)双抗(Gibco);胎牛血清(fetal calf serum，FCS)(杭州四季青);Ficoll淋巴细胞分离液(相对密度1.077 g/L)(Lymphoprep);重组人粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子(recombinant human granulocyte macrophage colony－stimulating factor，rhGM－CSF)、重组人白细胞介素4(interleukin－4，IL－4)、肿瘤坏死因子－α(tumor necrosis factor－α，TNF－α)、重组人白细胞介素 －6(IL－6)、重组人白细胞介素－1β(IL－1β)(PeproTech);藻红蛋白(phycoerythrin，PE)标记小鼠抗人CD83与HLADR、异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)标记小鼠抗人CD86、CD80荧光单克隆抗体(Pharmingen);前列腺素 E2(prostaglandin－E2，PGE2)(Cayman);脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)(Sigma);活细胞荧光染料羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(carboxyfluoroscein succinimidylester，CFSE)(Molecular Probes);抗人 TRAF6抗体(Abcam);辣根过氧化物酶标记的鼠抗鸡Ⅱ抗(Santa Cruz);人IL－12 p40 ELISA检测试剂盒 (Diclone);Trizol Reagent(Gibco);DL 2000 DNA marker(TaKa-Ra);real－time PCR仪(Roche);UVP－GDS800紫外成像分析系统(UVI)。

1.2 人外周血样品 取自我校身体健康的大学生志愿捐献者，共5份，每份100 mL，均在献血后2 h内进行外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)分离。

2 方法

2.1 DCs的培养与诱导成熟 用Ficoll密度梯度离心法分离PBMC，PBS洗涤2次，用RPMI－1640完全培养基(含10%灭活胎牛血清，2 mmol/L L－谷氨酰胺，1×105U/L P－S双抗)将PBMC密度调到5×109/L，加入25 cm2培养瓶，37 ℃、5%CO2培养2 h，洗去非贴壁细胞保存备用。……