庄 鹏， 王湘郴， 罗国辉， 何 英， 吴正林

(深圳市第四人民医院感染科，广东 深圳518033)

CD4+CD25+FOXP3+是调节性T 细胞(regulatory T cells，Tregs)公认的鉴别标记，Treg 可通过与T细胞的相互作用发挥免疫调节机制［1］。HBV 感染后机体不充分的特异性细胞毒性T 淋巴细胞(cytotoxic T-lymphocytes，CTLs)应答不仅不能清除病毒，反而可通过介导非特异性T 细胞应答导致肝脏损伤［2］。为进一步探讨Treg 在乙型肝炎发病中的作用，本研究采用“一步法”流式检测Treg 细胞技术对慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)患者外周血中CD4+CD25+FOXP3+Treg 细胞的频率特点进行了观察，同时使用酶联免疫斑点方法对CHB 患者HBV 抗原特异性CTLs 的表达进行了检测，现报道如下。

材 料 和 方 法

1 资料

1.1 研究对象 选择28 例在我院感染科门诊就诊的HBeAg 阳性且未应用过核苷类似物治疗的CHB患者，诊断符合《慢性乙型肝炎防治指南》标准。其中男性17 例，女性11 例。年龄16 - 58 岁，平均(35.56 ±14.78)岁。另选取健康对照组15 例，其中男性10 例，女性5 例，年龄18 -65 岁，平均(37.52 ±14.25)岁，均无肝炎病史，肝炎病原学血清标志物检测均阴性，肝功能均正常。

1.2 入选标准 观察组筛选前HBsAg 阳性至少6个月，筛选时血清丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)水平升高(≥2 -10 倍正常上限，upper limits of normal，ULN);定量测定血清HBV DNA 水平≥108copies/L。所有病例均排除合并肿瘤、自身免疫性疾病、酒精性肝病、药物性肝炎、遗传性肝病及丙型肝炎病毒(hepatits C virus，HCV)、丁型肝炎病毒(hepatits D virus，HDV)、人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)混合感染等，也未经任何抗病毒或免疫调节药物治疗。

1.3 主要试剂和仪器 One Step Staining Human Treg FlowTMKit (FOXP3 Alexa Fluor® 488/CD25 PE/CD4 PerCP，Biolegend);HBV ELISPOT Kit、EZ - Sep人淋巴细胞分离管、Lympho - SpotTM无血清培养基(达科为公司);Cell Staining Buffer (FBS，Biolegend);HBV DNA 试剂盒(深圳匹基生物工程有限公司)，流式细胞仪(BD)。

2 方法

2.1 外周血单个核细胞的分离采集与计数 取5 mL新鲜外周血(肝素抗凝)加入分离管，放入离心机。……