凌育赵，刘经亮

(1.仲恺农业工程学院化学化工学院，广东 广州 510225；2.广东食品药品职业学院，广东 广州 510520)

虎舌红(Ardisiamamillata)，又名红毛毡、宝鼎红、天仙红衣、毛凉伞、金丝红珠等，为紫金牛科紫金牛属[1]，具有清热利湿、活血止血、去腐生肌等功效，对跌打损伤、风湿骨痛、肺痨咳嗽、疳积肝炎等均有疗效[2]。黄酮类化合物是紫金牛属植物的主要活性成分之一[3]，用于防治皮肤疾病、增强免疫力和预防心血管疾病等方面[4]，具有抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、降血脂等广泛的生物活性与功效[5]。

目前，国内对虎舌红活性成分的研究，主要集中在挥发油、生物碱及多糖类[6～8]，而对虎舌红黄酮类成分的研究尚未见相关报道。作者在前期研究的基础上，采用索氏回流法及溶剂萃取法，成功地提取了虎舌红中的总黄酮，并以芦丁为标准品，应用红外光谱仪对提取物中总黄酮的含量进行了测定。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

虎舌红全草由广东省农科院芳村花卉基地提供，经仲恺农业工程学院植物研究室鉴定为紫金牛科(Myrsinacese)紫金牛属(Ardisia)虎舌红。

芦丁标准品，中国药品生物制品检定所；溴化钾、盐酸、乙醇、石油醚、乙酸乙酯、镁粉等，均为分析纯。

IRPrestige21型傅立叶变换红外光谱仪，美国NICOLET公司；752C型紫外可见分光光度计，上海第三分析仪器厂；KQ3200DE型数控超声波清洗器，苏州江东精密仪器有限公司；FA-1004型电子天平，上海精密科学仪器有限公司；RE-52型旋转蒸发仪，上海亚荣公司。

1.2 虎舌红总黄酮的提取与鉴定

1.2.1 虎舌红总黄酮的提取

称取粉碎过筛的虎舌红粉末20.0 g，置于烧瓶中，加入8 BV 75%(体积分数，下同)的乙醇，于80 ℃下索氏回流提取5次，每次2.5 h。抽滤，收集滤液，减压回收乙醇溶剂，挥干，浓缩得浸膏0.45 g。用适量热水溶解浸膏，趁热过滤除去不溶物，然后加入1/3体积的石油醚(脱脂，并除去部分色素)，振荡静置分层；弃去石油醚溶解物，在萃取后的水溶液中加入1/3体积的乙酸乙酯萃取4次，收集乙酸乙酯相，旋转蒸发仪挥去溶剂得总黄酮0.38 g，收率1.90%。

1.2.2 虎舌红总黄酮的鉴定

(1)HCl-镁粉反应。取上述提取物少许，置于试管中，加75%乙醇 2 mL，在水浴中加热溶解，滴加浓盐酸2滴，再加镁粉约 0.50 g，即发生剧烈反应，生成的泡沫呈明显红色，溶液颜色逐渐由黄色变为橙红色。据此鉴定提取物为黄酮类物质。

(2)红外光谱鉴定。取烘干后的芦丁少许，加入一定量的溴化钾，制成固体压片，用傅立叶变换红外光谱仪在扫描范围 4000～400 cm-1、分辨率 4 cm-1、扫描次数为 4的条件下绘制红外光谱图；同法绘制精制虎舌红提取物的红外光谱图，对比鉴定。

2 结果与讨论

2.1 虎舌红总黄酮的红外光谱分析(图1)

A.芦丁标准品 B.虎舌红提取物

由图1可知，芦丁标准品和虎舌红提取物的红外光谱分别在3296.90～3425.78 cm-1左右均出现宽而强的吸收峰，是-OH的伸缩振动峰，表明存在酚羟基或糖上的羟基，且数目较大；在2973.34 cm-1处出现弱吸收峰，是碳氢键的伸缩振动峰，说明饱和碳上的氢较少；在1655.80 cm-1、1662.15 cm-1处出现 C=O的伸缩振动中强峰，两者位置和峰型一样，说明提取物是黄酮类物质；在1614.50 cm-1、1505.81 cm-1处出现强吸收峰，是芳环中C=C的伸缩振动吸收峰，也是黄酮的特征吸收峰；在 1093.21 cm-1左右出现较强吸收峰，是C-O的伸缩振动峰；在1355.60 cm-1、1143.25 cm-1处出现羟基的弯曲振动峰；在 807.28 cm-1处出现苯环邻位氢引起的吸收峰；在 1000～600 cm-1处出现苯环上取代基位置引起的吸收峰，但峰位置不同，说明提取物与芦丁的羟基取代位置不同；其它位置的吸收峰基本一致。这些表明，提取物中含有羟基、羰基、碳氧单键以及不同位置取代的苯环等官能团，特征吸收峰一致。因此可确定提取物是黄酮类化合物。

2.2 紫外可见分光光度法测定虎舌红中总黄酮含量

以芦丁为对照品，采用NaNO2-AlCl3比色法测定总黄酮含量[6]。

2.2.1 标准曲线的绘制

准确移取40 μg·mL-1芦丁标准溶液0.00 mL、2.00 mL、4.00 mL、6.00 mL、8.00 mL、10.00 mL于50 mL容量瓶中，加入0.50 mol·L-1NaNO2溶液1.00 mL，摇匀，静置5 min；加入0.30 mol·L-1AlCl3溶液1.00 mL，摇匀；加入1.00 mol·L-1NaOH溶液5.00 mL、50%乙醇定容至刻度，放置15 min，于410 nm处测定吸光度。以吸光度(A)对浓度(c)进行线性回归，得回归方程为A=0.4275c+0.0003，R=0.9987，芦丁在0.080～0.400 mg·mL-1范围内呈良好线性关系。

2.2.2 含量测定

取适量样品溶液，按2.2.1方法测定吸光度，据回归方程计算得总黄酮含量为19.54 mg·g-1。

2.3 红外光谱法测定虎舌红中总黄酮含量

2.3.1 标准曲线与检出限

黄酮类化合物4-位大多数有羰基，这是黄酮类化合物分子结构特征。红外光谱图中，在 1662.15～1505.81 cm-1范围内羰基有较强的吸收，其吸收强度与含量有关，且不易受其它峰的影响，因此选择羰基峰为定量峰，红外定量峰面积由两侧的峰谷确定。

在定量程序中建立标准品的红外光谱图，以1662.15～1505.81 cm-1范围内吸光度(A)的面积值作为定量值，用傅立叶变换红外光谱仪的朗伯-比耳定量程序建立标准曲线。以芦丁质量(M，mg)对峰面积(S)进行线性回归，得到：M=0.0359S-0.3547，相关系数为0.9803。本方法的检出限为0.04 mg。

2.3.2 含量测定

准确称取样品溶液6份，称取相应的溴化钾使质量总和在0.0850～0.0860 g之间。按2.3.1方法绘制红外光谱图，应用朗伯-比耳定量程序计算，结果见表1。

表1 红外光谱测定提取物中总黄酮含量

由表1可知，提取物中总黄酮的平均含量为19.47 mg·g-1。与紫外可见分光光度法测定结果基本一致。

2.3.3 吸光系数K

从红外光谱图上得到样品的吸光度，再根据固体压片的厚度计算吸光系数K为2.379×103g·cm-1。

2.4 加标回收率实验

采用测定标准品(芦丁)和试样加标回收实验方法，进行加标回收率实验，结果见表2。

表2 加标回收率实验结果

由表2可知，回收率在93.54%～104.35%之间，平均回收率为98.72%；其相对标准偏差(RSD)为 2.09%(n=6)，说明方法精密度高。

3 结论

应用红外光谱法测得虎舌红中的总黄酮含量为19.47 mg·g-1，与紫外可见分光光度法测定结果(19.54 mg·g-1)基本一致。红外光谱法测定虎舌红中总黄酮含量时吸光系数达到 2.379×103g·cm-1，吸光系数K较小，适合于常量分析，相对标准偏差(RSD)为2.09%(n=6),加标回收率为93.54%～104.35%，平均回收率为98.72%。该法操作简便、结果可靠，可用于黄酮类有效成分的质量监控。

[1] 卢其能.虎舌红的生物学特性与组织培养研究[J].江西林业科技，2002，(1)：5-6.

[2] 赵亚，刘合刚.紫金牛属植物研究近况[J].中草药，1999，30(3)：228-231.

[3] 姚新生．天然药物化学(第二版)[M].北京：人民卫生出版社，1996：194.

[4] 国家药典委员会.中华人民共和国药典一部[M].北京：化学工业出版社，2000：629.

[5] 黄河胜，马传庚，陈志武.黄酮类化合物药理作用研究进展[J].中国中药杂志，2000，25(10)：589-592.

[6] 凌育赵，曾满枝，严志云.超临界萃取气-质联用分析虎舌红挥发油化学成分[J].精细化工，2005，22(10)：766-769.

[7] 凌育赵，曾满枝.虎舌红生物碱类成分的提取分离与结构鉴定[J].精细化工，2007，24(7)：667-670.

[8] 凌育赵，曾满枝.虎舌红多糖的分离纯化与性质研究[J].分析试验室，2007，26(4)：93-96.