陈樱花 位红兰 隽晨霞 刘正钊 章海涛 刘志红 胡伟新

循环内皮细胞损伤标记物与抗中性粒细胞胞质抗体相关血管炎活动性的联系

陈樱花 位红兰 隽晨霞 刘正钊 章海涛 刘志红 胡伟新

目的：探讨外周血液中内皮细胞损伤标记物循环内皮细胞（CECs）数量、可溶性血栓调节蛋白（sTM）、血浆血管性假血友病因子（vWF）、E选择素（ES）和血管细胞黏附分子1（VCAM-1）水平与抗中性粒细胞胞质抗体（ANCA）相关血管炎（AAV）活动性的联系。 方法：84例AAV患者，根据伯明翰评分（BVAS）评估血管炎活动性将其分为活动组（n=56，男性23例，女性33例，平均年龄48.1±16.8岁，BVAS评分13.6±2.4分）和缓解组（n=28，男性9例，女性19例，平均年龄50.2±16.4岁，BVAS评分0分）。性别、年龄相匹配健康志愿者20例为对照组。免疫磁珠分离方法检测CECs数量，ELISA法检测血浆sTM、vWF、ES和VCAM-1水平，并分别比较三组上述指标的差异。 结果：活动组CECs、sTM、vWF和ES水平均显著高于健康对照组（P＜0.01）。缓解组血CECs、sTM、vWF和ES与健康对照组比较无显著差异，活动组和缓解组血浆VCAM-1水平与健康对照组比较均无显著差异。与缓解组比较，活动组CECs［（30±12）个/m l vs（17±5）个/ml，P＜0.01］与sTM［（9.5±6.8）ng/ml vs（6.1± 3.4）ng/ml，P＜0.01］水平显著升高，但经血清肌酐（SCr）校正后，两组间sTM水平无显著差异。两组间血浆vWF和ES也无显著差异（P＞0.05）。活动组sTM水平与SCr和尿蛋白水平呈正相关性，CECs、vWF、ES和VCAM-1水平与SCr和尿蛋白无相关性。 结论：循环内皮细胞数量与血管炎活动性密切相关，可作为临床判断ANCA相关血管炎活动性的重要指标。

内皮细胞损伤标记物 循环内皮细胞 血管炎 抗中性粒细胞胞质抗体

抗中性粒细胞胞质抗体（ANCA）相关血管炎（ANCA associated vasulitis，AAV）是指ANCA诱导小血管壁的免疫性炎症和坏死并导致多个器官组织损伤及功能障碍的一类系统性疾病。典型的AAV组织学特征为血管壁的纤维素样坏死，早期血管内膜肿胀、内皮细胞剥脱，内皮损伤是小血管炎发生的基础。判断AAV病情活动性对临床治疗过程中调整免疫抑制剂方案至关重要，但目前尚缺乏敏感特异的方法，因此需要寻找判断AAV活动程度的生物标记物。

ANCA可活化内皮细胞，刺激内皮细胞表达和释放多种膜表面分子如可溶性血栓调节蛋白（soluble thrombomodulin，sTM）、血管性假血友病因子（von willebrand factor，vWF）、E选择素（E-selectin，ES）和血管细胞黏附分子1（vascular cell adhesion molecule，VCAM-1），促进白细胞的附壁和黏附，导致血管内皮损伤，损伤的内皮细胞脱落进入外周循环。循环内皮细胞（circulating endothelial cells，CECs）数量和外周血液中内皮细胞表达的可溶分子水平反映内皮细胞的损伤程度。血管内皮损伤是血管病变的始动环节，既往研究显示血管内皮细胞损伤标记物对评估狼疮性肾炎肾血管病变具有重要的意义［1，2］，但尚无在AAV中的研究报道，国外关于此方面的研究也甚少［3，4］。本研究重点探讨了外周血液中血管内皮细胞损伤标记物与AAV活动性的联系。

对象和方法

对象 选择2009年1月～2011年7月南京军区南京总医院肾脏科84例符合Chapel Hill诊断标准的AAV患者［5］，临床分类包括微型多血管炎（microscopic polyangitis，MPA）、Wegener肉芽肿（Wegener granulomatosis，WG）和Churg-strauss综合征（CSS）。治疗前血清ANCA均阳性，有明确肾脏受累，出现血尿、蛋白尿、肾功能不全和高血压，肾活检病理为寡免疫复合物节段坏死性新月体肾炎；伴或不伴其他脏器如肺、副鼻窦、皮肤和关节损害等；排除继发性血管炎，如过敏性紫癜、药物过敏、狼疮性血管炎和感染等。

AAV的活动性采用伯明翰血管炎活动性评分（BVAS）评估［18］，将84例患者分为活动期（n=56）和缓解期（n=28）。20例健康志愿者作为健康对照组。

肾组织病理检查 肾组织进行常规光镜及免疫荧光检查。光镜检查肾组织经石蜡包埋，切片厚度1.5μm，行常规HE、PAS、PASM、Masson三色染色。观察肾组织肾小球新月体比例、袢坏死及肾血管病变等。免疫荧光采用冰冻切片，观察肾组织IgG、IgA、IgM、C3、C4、C1q的沉积强度及部位。

ANCA检测 ELISA法（试剂购自Euroimmun，德国）检测抗髓过氧化酶抗体（MPO-ANCA）、抗蛋白酶3抗体（PR3-ANCA）。间接免疫荧光检测pANCA、cANCA。

CECs检测 CECs数量采用免疫磁珠分离方法检测［6］。具体方法：抽取外周血2 ml，用乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝。洗涤M-450磁珠（Dynal，Hamburg，Germany），将稀释后的抗CD-146单抗（Biocytex，Marseilles，France）包被在磁珠表面，4℃孵育30 min，PBS洗涤后，用小牛血清封闭10 min，再次经PBS洗涤后，加入1 ml EDTA抗凝全血，混匀后，4℃孵育30min，PBS洗涤后，用100μl PBS悬浮磁珠，最后在显微镜下用细胞计数板计数，单位为个/m l。内皮细胞的鉴定标准：（1）细胞形态：较大体积的圆形或椭圆型细胞（直径10～50μm）；（2）必须和4个以上磁珠结合。

sTM和vWF检测 抽取全血1.8 ml，与枸橼酸抗凝剂0.2 ml按9∶1比例混合抗凝，留取血浆，-70℃冻存待测。sTM和的vWF测定采用ELISA法，检测sTM试剂盒购自法国DIACLONE公司，检测vWF试剂盒购自上海太阳生物科技有限公司，具体方法严格按说明书进行。每份标本同时测定2次，取均值。

VCAM-1和ES检测 抽取全血2 ml，留取血清，-70℃冻存待测。VCAM-1和ES的测定采用ELISA法，试剂盒购自法国DIACLONE公司，具体方法严格按说明书进行。每份标本均同时测定2次，取均值。

治疗 活动期AAV均先静脉注射甲泼尼龙0.5g×3d，后口服泼尼松［起始剂量为 0.6mg/（kg·d）］，4周后逐渐减量至10 mg/d维持。并给予吗替麦考酚酯（MMF）1 g/d或间断环磷酰胺（CTX）静脉冲击（NIH方案）诱导治疗。缓解期采用激素联合MMF（0.5～0.75 g/d）或硫唑嘌呤［1～2 mg/（kg·d）］治疗。

统计学方法 采用SPSS 16.0软件进行统计分析。以单样本Kolmogorov-Smirnov Z检验对数据进行正态检验。所有正态分布的计量资料，以均数±标准差表示，两组之间均数比较采用t检验，多组之间均数比较应用方差分析。计数资料以百分率表示。正态分布数据采用Pearson相关系数，非正态分布数据采用Spearman相关系数评价变量间的相关性。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

临床资料 84例AAV患者中MPA 75例，WG 4例，CSS 5例；血清ANCA类型MPO-ANCA阳性72例（另有8例在治疗缓解后转阴），PR3-ANCA阳性4例。根据AAV活动性分为两组，活动组56例，其中男性23例，女性33例，平均年龄48.1±16.8年，BVAS评分13.6±2.4分，MPO-ANCA阳性53例，PR3-ANCA阳性3例；缓解组28例，其中男性9例，女性19例，平均年龄50.2±16.4年，BVAS评分0分，MPO-ANCA阳性19例，PR3-ANCA阳性1例。所有患者均行肾活检，肾组织病理示坏死性新月体性肾炎（表1）。

内皮细胞损伤标记物与AAV活动性的联系与健康对照组比较，活动组CECs、sTM、vWF和ES水平均显著升高（P＜0.01），缓解组血CECs也显著升高（P＜0.05），但vWF、sTM和ES较健康对照组比较无显著差异。活动组和缓解组血浆VCAM-1水平与健康对照组比较均无显著差异。活动组CECs和sTM水平均显著高于缓解组（P＜0.01），血浆vWF和ES与缓解组比较无显著差异（P＞0.05）（表2）。但 sTM水平受肾功能的影响，缓解组sTM/SCr较活动组显著升高［（4.6±1.8）/100 vs（3.3±2.0）/100，P＜0.01），经SCr校正后，活动组和缓解组间sTM水平无显著差异。16例活动期AAV经激素联合免疫抑制剂治疗达缓解后血CECs数量较治疗前显著减少（P＜0.01），血sTM、vWF和ES水平较治疗前下降，但无统计学差异（表3）。

表1 两组患者的临床及病理资料

表2 内皮细胞损伤标记物与血管炎活动性的关系

内皮细胞损伤标记物与脏器受累的联系 84例AAV患者中17例伴有肾外脏器活动性损害（包括肺出血8例，关节痛4例，皮疹4例，其他1例）。比较有无伴肾外脏器受累两组AAV患者血CECs、sTM、vWF、ES和VCAM-1水平均无显著差异（P＞0.05）（表4）。肺出血组患者血vWF水平显著高于无肺出血AAV组（P＜0.05），两组间血CECs、sTM、ES和VCAM-1水平均无显著差异（P＞0.05）（图1）。

表3 治疗前后内皮细胞损伤标记物水平的比较

表4 内皮细胞损伤标记物与肾外脏器损害的联系

图1 血浆血管性假血友病因子（vWF）与肺出血的联系

AAV活动组内皮细胞损伤标记物与肾损害指标的联系 活动组血sTM水平与SCr（r=0.42，P＜0.01）和24h尿蛋白定量（r=0.33，P＜0.05）正相关（图2），与尿沉渣红细胞计数无相关性（r=0.11，P＞0.05）。sTM水平升高者SCr水平显著高于sTM水平正常患者［（362.4±194.5）μmol/L vs（212.2±176.8）μmol/L，P＜0.01］，两组间尿蛋白水平升高，但无显著差异［（2.5±1.9）g/24h vs（1.9±1.3）g/24h，P＞0.05］。血CECs、vWF、ES和VCAM-1水平与SCr、尿蛋白定量和尿沉渣红细胞计数均无相关性。活动组血CECs、sTM、vWF、ES和VCAM-1水平与肾组织新月体和袢坏死程度均无相关性（P＞0.05）。

图2 sTM与SCr和24h尿蛋白定量的相关性

讨 论

临床治疗过程中AAV活动性的判断至关重要，但常较困难。传统根据受累脏器损伤的临床情况判断AAV活动性的BVAS评分敏感度低，评估的患者已出现明显甚至严重的脏器受损，不能有效评估器官累及的范围和严重程度，区分血管炎活动性或非活动性病变导致的器官损伤有时比较困难。ANCA水平的变化可帮助判断AAV的活动性，但其与AAV活动性的关联也是有限的［7］。肾组织活检能显示活动性和慢性病变的程度，但存在取材局限，可重复性差，不利于治疗中动态监测。内皮损伤和纤维素样坏死是AAV的显著特征，活化的内皮细胞和中性粒细胞相互作用是AAV发生的关键，检测内皮细胞及其表达的可溶性分子水平是反映内皮损伤的直接方法。

本研究分析了CECs、sTM、vWF、ES和VCAM-1五种反映血管内皮细胞损伤的标记物与AAV活动性的联系发现，除血VCAM-1外，血CECs、sTM、vWF和ES水平在AAV活动期均显著升高；在AAV缓解期，血CECs和sTM水平显著下降，且与健康对照组无差异，但经SCr校正后，sTM水平变化无差异，血vWF和 ES水平下降，但未达统计学差异，表明CECs与AAV活动性关系更为密切，动态监测CECs能反映AAV活动性。既往研究显示单个血管内皮细胞损伤标记物如CECs数量增加反映血管炎的活动性［8，9］，本研究综合了五种血管内皮细胞损伤标记物，表明AAV存在明显的血管内皮细胞损伤，在内皮细胞从活化到损伤的不同阶段均存在异常，其中CECs数量与血管炎活动性密切相关。本文大多病例为MPA，病程迁延，急慢性病变并存，可能与本文检测CECs数量和sTM、vWF、ES和VCAM-1水平低于文献报道的有关。

血管内皮损伤后，内皮细胞脱落，可在外周血中检出异常增高的CECs，因此这是反映血管内皮损伤的可靠性指标。本研究也显示活动组CECs数量较健康对照组及缓解组均明显升高，治疗后明显减少，表明CECs数量与AAV的活动性相关。已有研究报道疾病活动期AAV外周血中的CECs数量明显增加，经免疫抑制剂治疗缓解后，内皮细胞数量明显减少，病情复发时，内皮细胞数量又升高，并且在无血管病变的患者血液中未检出内皮细胞升高［3，6，8］。本文有关血CECs数量与血管炎活动性的联系与文献报道一致，即活动期CECs数量显著升高，缓解期CECs数量显著下降。但本文活动组平均CECs数量30个/ml，低于文献报道新诊断的AAV平均CECs数量56个/ml和复发的AAV平均CECs数量88个/ml［8］，这可能与治疗或与疾病本身累及血管病变的活动性有关，也可能与检测方法不一致有关。

血栓调节蛋白（TM）主要分布于内皮细胞表面，具有抗凝作用。内皮细胞损伤后，TM大量释放于血成为sTM，内皮细胞上的TM减少，抗凝作用减弱，血液向促凝状态偏移，导致血栓形成。sTM水平反映血管、尤其是小血管和毛细血管内皮细胞受损的程度。本研究显示活动组sTM水平较健康对照组及缓解组均明显升高，sTM水平与SCr和尿蛋白正相关。也有文献报道系统性血管炎中血sTM水平升高［9］，活动性WG血sTM水平较正常对照组显著升高［10］，反映血管炎的活动性。在肾功能受损时，由于肾小球滤过率（GFR）下降，sTM从肾脏滤过减少，导致血浆sTM升高［11］。本文校正肾功能影响，sTM水平在活动组和缓解组无显著差异，因此在有肾功能损害的AAV，sTM反映AAV活动性存在一定的局限性。

本研究还发现活动组AAV患者的血ES和 vWF水平较健康对照组显著升高，但与缓解组比较无显著差异。ES是一种黏附分子，介导内皮细胞与白细胞黏附，ES表达增高是内皮细胞损伤的早期变化，可作为内皮细胞活化的可靠标志［12］。在AAV的研究中发现，炎症部位中性粒细胞浸润大多在ES存在的情况下发生，抗ES单抗能明显改善实验动物肺与皮肤的血管通透性，减少中性粒细胞在炎症部位的聚集、迁移［13］。VCAM-1参与白细胞与内皮细胞的紧密黏连，促进炎症细胞与内皮细胞的黏附和炎症细胞在血管壁的浸润，也是内皮细胞激活和早期损伤的标志［16］。有研究显示AAV中VCAM-1水平明显升高［17，4］，并且与AAV的预后相关。但由于本组病例均非AAV早期，ES和VCAM-1水平升高，但ES和VCAM-1表达异常非最高峰时期，因此活动组较缓解组升高不明显。

内皮细胞损伤后，胶原暴露可激活血小板黏附及凝血，存在于血小板及内皮细胞中的vWF在细胞损伤后释放可加速血小板的黏附及聚集，导致内皮损伤，vWF是反映细胞损伤敏感的分子标记物［14］，有研究显示WG患者血vWF水平升高［15］。本研究中伴肺出血的AAV血vWF水平显著升高，表明vWF水平与肺血管内皮损伤密切相关，但未发现vWF与肾损伤活动性有关。

综上所述，本研究发现CECs数量与血管炎活动性密切相关，可作为临床判断血管炎病情的重要指标，但仍需进一步的临床观察加以证实。

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Significance of circulating endothelial biomarkers in patientsw ith ANCA associated vasculitis

CHEN Ying-hua，WEIHong-lan，JUAN Chen-xia，LIU Zheng-zhao，ZHANGHai-tao，LIU Zhi-hong，HUWei-xin
Research Institute of Nephrology，Jingling Hospital，Nanjing University School of Medicine，Nanjing 210002，China Corresponding author：HUWei-xin（E-mail：huwx64@medmail.com.cn）

Objective：To detect various endothelial markers of circulating endothelial cells（CECs），soluble thrombomodulin（sTM），von Willebrand factor（vWF），E-selectin and Vascular cell adhesion molecule 1（VCAM-1）in patients with active and remission stage of ANCA associated vasculitis，and to explore the relationship between endothelial markers and the activity of ANCA associated vasulitis（AAV）. M ethodology：Fifty six patientswith AAV in active phase［M：23，F：33，mean age（48.1±16.8）y，BVAS score（13.6±2.4）］，28 patients in remission phase［M：9，F：19，mean age（50.2±16.4）y，BVAS score 0］，and 20 healthy controls were enrolled in this study.The CECs were isolated from peripheral blood by use of Dynabeads coated with antibodies against CD146，and the plasma sTM，vWF，E-selectin and ignificance of VCAM-1 were detected with ELISA. Results：CECs，vWF，E-selectin and sTM levels，but not VCAM-1，were higher in the active phase of AAV than that in controls（P＜0.01），no significant differences of endothelialmarkers were found between AAV patients in remission and controls.The CECs［（30±1）cells/ml vs（17±5.0）cells/ml，P＜0.01］and levels of plasma sTM［（9.5±6.8）ng/ml vs（6.1±3.4）ng/ml，P＜0.01］were significant increased in active AAV patients than that in remission，whereas corrected for renal function，sTM did not significant，and plasma vWF and E-selectin levels showed no significant differences between patients in active phase and in remission patients.The sTM level in the active phase was positive related with serum creatinine and urine protein，while elevated sTM levels were associated with higher serum creatinine levels.The endothelialmarkers had no relation with crescents and fibrinoid necrotic lesion.Conclusion：Circulating endothelial cells is potential biomarker in evaluating the activity of ANCA associated vasulitis. Key words circulating endothelial biomarkers endothelial cells vasulitis ANCA

2011-07-12

（本文编辑 莫 非 律 舟）

江苏省“六大人才高峰”第七批资助项目

南京军区南京总医院全军肾脏病研究所（南京，210002）

胡伟新（E-mail：huwx64@medmail.com.cn）

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