高红伟 刘中浩 邢德国 王 亮 宫明智

(山东大学第二医院骨外一科，山东 济南 250033)

糖尿病因其高发病率、高致残率引起世人关注，而在糖尿病基础上发生的骨质疏松使患者生活质量下降，且容易导致骨折，严重加重家庭及社会经济负担。绝经后骨质疏松是老年妇女常患的一种代谢性骨病。绝经后的老年糖尿病病人常是糖尿病性骨质疏松和绝经后骨质疏松并存，此类病人在临床上较为常见，因此其防治引起了人们的关注。雌激素、一氧化氮(NO)、转化生长因子 β1(TGF-β1)已被证实与骨代谢有关〔1～4〕。本实验通过观察糖尿病去势大鼠模型中 NO、TGF-β1、雌激素、骨密度的变化，探讨糖尿病与绝经导致骨质疏松的机制，以及糖尿病与绝经在骨质疏松发生上有无相互作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料 链脲佐菌素(美国Sigma公司)，NO试剂盒(南京建成生物研究所)，ELISA试剂盒(德国 DRGGmbH公司)，双能X射线骨密度测定仪(美国NORLAND)，兔抗大鼠TGF-β1单克隆抗体，生物素化山羊抗兔 IgG，TGF-β1SABC试剂盒(武汉博士德公司)，Leica-Qwin计算机图像分析系统(德国)。

1.2 实验动物模型制备 健康清洁级3月龄雌性Wistar大鼠160只，体质量180～200 g，由山东大学动物实验中心提供。将160只大鼠随机分为四组:正常对照组(A组)，糖尿病模型组(B组)，单纯去势模型组(C组)，糖尿病并发去势模型组(D组)。①糖尿病模型组(B组):随机选取3月龄Wistar雌性大鼠80只，腹腔内注射链脲佐菌素60 mg/kg，定向破坏胰岛细胞，3 d后测血糖高于16.8 mmol/L者为糖尿病大鼠模型制作成功。②单纯去势模型组(C组):随机选取3月龄Wistar雌性大鼠40只，腹腔内注射1%戊巴比妥钠30 mg/kg体重，麻醉成功后，将该种动物固定，下腹部剪毛，用碘酒、酒精常规消毒局部，于无菌条件下取下腹正中切口，长约1.5 cm，逐层钝性分离进入腹腔，完整切除双侧卵巢，止血后逐层缝合、关腹。术后肌肉注射青霉素2万U/kg共7 d，术后7 d拆线。③糖尿病并发去势模型组(D组):随机选取成模后1 w的糖尿病大鼠模型40只，在此基础上进行去势手术，方法同②。④正常对照组(A组):随机选取3月龄Wistar雌性大鼠40只，腹腔内注射生理盐水，1 w后行手术，手术方式同“去势”手术，不切除卵巢，只切除大网膜脂肪。

1.3 血清雌激素、NO、TGF-β1检测 分别于第4，8，12，16周自股静脉取两组大鼠血液，高速离心后取血清，放置于-20℃冰箱内。采用放免法测血清雌激素水平;硝酸还原酶法测血清NO水平;ELISA法检测血清TGF-β1水平。

1.4 骨密度(BMD)检测 分别于第4，8，12，16周麻醉状态下于两组中各取10只大鼠的右侧股骨，制作病理切片，以双能X射线骨密度测定仪检测骨密度。

1.5 免疫组织化学染色检测股骨TGF-β1的表达 采用SABC法进行免疫组织化学检测，实验步骤按说明书操作。TGF-β1一抗工作浓度为1∶50，棕黄色至深褐色染色为阳性染色。应用Leica-Qwin计算机图像分析系统在相同灰度阈值设定条件下，自动测出视野内免疫荧光阳性染色灰度值。

1.6 统计学分析 数据均以x±s表示，采用SPSS16.0统计软件进行方差分析，同时应用LSD及Dunnet-t检验，分析糖尿病及卵巢去势两因素间是否存在相互作用。

2 结果

2.1 大鼠血清雌激素水平 随着实验的进行，四组大鼠雌激素水平均逐渐降低。四组相比较，B组与A组差异、C组与D组差异无统计学意义，C、D组与A、B组差异有统计学意义。A、B两组雌激素水平各时间点差异无显著性意义，C、D两组第4和8周、第8和16周差别有统计学意义(P＜0.05)。LSD及Dunnet-t检验分析糖尿病与卵巢去势对雌激素影响无相互作用。见表1。

2.2 大鼠血清NO水平 实验结果显示，四组大鼠血清NO水平均逐渐降低。四组相比较，B、C、D组与A组差异有统计学意义，C组与D组差异无统计学意义。而C与B、D与B相比，血清NO水平降低更为明显，其差异均有统计学意义。A组血清NO水平各时间点差异无显著性意义，B、C、D各组第4和8周、第8和16周差别有统计学意义(P＜0.05)。LSD及Dunnet-t检验分析糖尿病与卵巢去势对血清NO水平影响无相互作用。见表2。

表1 大鼠血清雌激素水平(x ±s，n=10，nmol/L)

2.3 大鼠血清TGF-β1水平 实验结果显示，A、D大鼠血清TGF-β1水平变化不明显，各时间点无统计学差异，且两组相比亦无统计学差异。B组血清TGF-β1水平逐渐升高，各时间点有统计学差异。C组血清TGF-β1水平逐渐降低，各时间点亦有统计学差异。B、C与A组相比，差异明显(P＜0.05)。同样LSD及Dunnet-t检验分析糖尿病与卵巢去势对血清TGF-β1水平影响无相互作用。见表3。

表2 大鼠血清NO水平(x ±s，n=10，μmol/L)

表3 大鼠血清TGF-β1水平(x ±s，n=10，mg/L)

2.4 大鼠股骨BMD水平 实验结果显示，四组大鼠股骨BMD均逐渐降低。四组相比较，B、C、D组与A组差异有统计学意义。C与D、C与B差异无统计学意义，而D与B相比，差异明显(P＜0.05)。A组股骨BMD各时间点差异无显著性意义，B组第4和8周、第8和16周差别有统计学意义(P＜0.05)，C、D组第8和12周、第12和16周差别有统计学意义(P＜0.05)。LSD及Dunnet-t检验分析糖尿病与卵巢去势对股骨骨密度影响无相互作用。见表4。

2.5 大鼠骨组织中 TGF-β1的表达 A组大鼠骨组织中TGF-β1染色呈阳性，主要分布在成骨细胞胞质，部分骨基质中也有阳性表达，其阳性细胞染色数目逐渐下降，但各时间点差异无显著性意义(P＞0.05)。而B、C、D三组骨组织中TGF-β1的表达范围未变，但各时间点阳性细胞染色数目下降明显，甚至不表达，与A组对应时间点比较，表达明显降低(P＜0.01)。C与D、C与B相比差异无统计学意义，而D与B相比，差异明显(P＜0.05)。LSD及Dunnet-t检验分析糖尿病与卵巢去势对局部骨组织中TGF-β1的表达无相互作用。见表5、表6。

表4 大鼠股骨BMD水平(x ±s，n=10，g/cm2)

表5 大鼠骨组织中TGF-β1阳性细胞数水平(x ± s，n=10)

表6 大鼠骨组织TGF-β1灰度值水平(x ± s，n=10)

3 讨论

骨质疏松是一种系统性骨骼疾病，是导致骨折的重要原因。糖尿病可导致多个系统的病变，能影响骨代谢引起骨质疏松，雌激素缺乏也被认为是老年妇女出现骨质疏松的主要原因。而临床上常见到绝经后糖尿病病人，他们常同时存在糖尿病性骨质疏松和绝经后骨质疏松。有研究认为某些细胞因子会影响骨代谢，导致骨质疏松的发生〔5，6〕。

雌激素通过作用于成骨细胞上的雌激素受体，改善骨的代谢，减少骨的吸收，它还可抑制甲状旁腺介导的骨吸收并增加肠道和肾脏对钙的重吸收，升高血钙水平，促进骨的形成〔1〕。本实验说明去势仍是雌激素降低的主要因素，糖尿病对雌激素影响较小，当两因素同时存在时，统计学显示两者无相互作用。

NO广泛存在于机体的各种组织中，能诱导破骨细胞的凋亡，抑制成熟破骨细胞的活性，减少骨吸收〔2〕。本实验说明糖尿病、卵巢去势均可影响血清NO水平，使其降低。有研究显示NO与BMD有关〔3〕，并通过降低对破骨细胞活性的抑制作用，增强骨吸收，导致BMD降低，本实验结果与其相符。研究提示在去卵巢大鼠中，雌激素水平降低，可导致NO水平下降，减轻对破骨细胞活性的抑制，增加骨吸收〔4〕，导致BMD减低，本实验中卵巢去势组及糖尿病并发去势组的结果与其相符。但本实验提示糖尿病骨质疏松中可能存在其他机制导致NO降低。本实验推测糖尿病、卵巢去势两因素对血清NO水平具有叠加作用，也从另一角度支持了Undurti的研究。

TGF-β1在机体中广泛存在，尤其在骨组织中含量最为丰富。TGF是一类对靶细胞具有多种特殊作用的细胞生长和分化调节蛋白。TGF-β1在不同条件下，既可促进成骨细胞分化，又可降低其分化;而且还可支持破骨细胞形成，刺激骨的吸收;它是骨形成和骨吸收之间重要的偶联调节因子〔7〕。TGF-β1可以促进雌激素受体表达，增强雌激素抑制骨丢失的功能〔8〕;雌激素减少亦可通过直接作用于骨细胞引起TGF-β1分泌减少。本实验发现糖尿病大鼠血清TGF-β1逐渐升高，与正常组差别有统计学意义，这与Mather等〔9〕实验结果一致，他认为血清TGF-β1升高可能和高血糖、肾脏代谢以及RAS系统有关;单纯卵巢去势组血清TGF-β1降低，与正常组差别有统计学意义，这和既往研究相符〔10〕。另外，TGF-β1在对照组骨组织中呈阳性染色，主要分布在成骨细胞胞质，部分骨基质中也有表达，说明TGF-β1在正常情况下参与了骨代谢平衡的维持。而TGF-β1在糖尿病、卵巢去势组大鼠骨组织中表达较弱，说明糖尿病、卵巢去势均影响骨组织中TGF-β1的表达，导致骨代谢失衡。对实验中血清TGF-β1水平、阳性细胞数及灰度值的数据进行统计分析，未发现糖尿病与卵巢去势有相互作用，但根据各指标结果，我们仍推测糖尿病及卵巢去势间存在叠加作用，并推测糖尿病及卵巢去势不存在影响TGF-β1的共同径路，可能是通过不同途径影响骨组织中TGF-β1的结果。

本实验中，糖尿病组、单纯去势组及糖尿病并发去势组大鼠股骨BMD均降低，与正常组差别有统计学意义，并且糖尿病与卵巢去势对股骨骨密度的影响没有协同或拮抗作用，但两因素同时存在时骨密度降低较大，推测糖尿病与卵巢去势对骨密度的影响存在叠加作用。TGF-β1被证实与骨代谢有关，TGF-β1基因缺失可导致骨密度降低，同样NO也被证实可促进骨形成，抑制骨吸收，增加eNOS基因的表达或提供外源性NO均可导致骨密度升高〔11，12〕，这和本实验结果均相符。但是 NO，TGF-β1在骨质疏松的发生机制中是否有相互作用，在糖尿病及卵巢去势的干预下导致骨密度降低的原理仍需进一步的实验研究。

综上所述，糖尿病、卵巢去势以及两者同时存在时均能够引起大鼠骨密度降低，导致骨质疏松。糖尿病及卵巢去势对血清NO、血清TGF-β1、骨组织TGF-β1及骨密度的影响无明显的相互作用，但根据结果数据，我们推测两者对上述指标的影响存在叠加作用。即糖尿病与卵巢去势同时存在时，骨密度降低幅度更大，可出现更严重的骨质疏松。

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