靳 淇 陈海燕 王 威 孔 俭

(吉林大学第一医院干部病房，吉林 长春 130021)

目前，世界范围内降压治疗的趋势是在降压同时改善代谢紊乱，预防靶器官损害或逆转靶器官的重塑。自从胰岛素抵抗与高血压之间的关系被揭示，通过应用胰岛素增敏剂改善胰岛素抵抗的降压治疗，以达到降低高血压的发病率和病死率的策略和治疗方向正逐渐被人接受。本文利用吡格列酮配合生活方式干预作为纠正胰岛素抵抗的综合措施，重点观察采取综合措施纠正胰岛素抵抗对自发性高血压(SHR)大鼠心肌的保护作用，探讨改善胰岛素抵抗与高血压之间的关系。

1 材料与方法

1.1 动物 SHR大鼠33只，雄性，购自北京维通利华公司，鼠龄6～7 w，体重120～160 g，分为4～6只/笼饲养，室温20℃ ～24℃，控制昼夜光照，避免过多噪声及其他干扰。观察期为1 w，实验期为12 w。

1.2 方法

1.2.1 分组及给药方法 全部大鼠随机分为3组，观察饲养1 w使大鼠适应环境。①SHR空白组(SHR组，n=11)，予鼠粮及清水。②吡格列酮配合生活方式干预组(P组，n=11)，予盐酸吡格列酮45 mg/L，加入饮水中灌胃。批号:H20050200，厂家:日本武田药品工业株式会社，同时给予生活方式干预。③硝苯地平组(N组，n=11)，硝苯地平加入饮水中，140 mg/L灌胃。

1.2.2 生活方式干预方法 ①饮食控制方法:每周测量1次SHR组大鼠24 h进食量，计算平均进食量，P组每日清晨给予SHR组平均鼠粮的90%;②游泳方法及条件:P组每日观察游泳6～15 min，同一时间在安静条件下进行，以大鼠漂浮水面不动并出现头部下沉为停止信号，水温28℃ ～30℃，水深50 cm，保证大鼠不能触及底部及侧壁逃避运动。SHR组及N组大鼠仅放置于鼠笼中自由生活及进食。

1.2.3 血液采集方法 在实验第12周结束时，大鼠禁食8 h后，乙醚麻醉，仰位固定于手术台上，腹主动脉取血，血液标本10 min内以4 000 r/min速度离心5 min后2 h内送检，比色法测量血清中eNOS水平(eNOS试剂盒购于南京建成生物工程研究所)。

1.2.4 组织取材 将麻醉大鼠沿正中线剪开腹腔，开胸迅速取出心脏，用生理盐水冲洗残血后滤纸吸干。取左室游离壁心肌约0.3 cm×0.3 cm，置于10%中性甲醛溶液中固定。

1.2.5 光镜标本制作 大鼠左室游离壁心肌经乙醇充分脱水后，二甲苯透明，石蜡包埋，制成5μm厚的切片保存，苏木素-伊红(HE)染色，在200倍光镜(Olympus PM-10AO)下观察心肌病变的组织学形态。

1.2.6 免疫组化方法检测大鼠心肌eNOS蛋白表达 采用抗生物素-生物素-过氧化物酶复合物法(ABC)，按说明书操作，二氨基联苯胺(DAB)显色，兔抗大鼠eNOS抗体购于武汉博士德生物工程公司，以细胞质内呈现棕黄色颗粒，且其着色强度高于背景非特异性染色者判定为阳性。应用 LX70OLYMPUS显微镜Cooled CCD采集视野图片，采用计量分析系统(Image-Pro-Plus Analysis Software)进行分析，计算各组大鼠心肌阳性信号的平均密度。

1.3 统计学分析 应用SPSS13.0统计软件进行分析，数据资料以x±s表示，组间比较采用方差分析。

2 结果

2.1 一般情况 实验前期，各组大鼠饮食及活动正常。实验开始后，SHR组及N组大鼠不限制鼠粮及饮水，P组每日清晨给予SHR组前1 w每日平均进食量的90%。P组大鼠第1周游泳时间为6～8 min，第12周时可坚持到15 min，呈现逐渐延长趋势。整个实验期大鼠无意外死亡。

2.2 大鼠血清eNOS水平 P组大鼠血清中eNOS含量〔(20.2±3.9)U/ml〕最高，与 SHR 组〔(16.7 ±4.2)U/ml〕相比差异有显著性意义(P＜0.05)，SHR组与N组大鼠血清中eNOS含量〔(16.0±2.6)U/ml〕相比差异无显著性意义。

2.3 大鼠心肌光镜观察结果 SHR组:心肌间质扩大、水肿，心肌内层可见点状或微小心肌坏死，局部伴少量单核细胞及淋巴细胞浸润，心内膜和心外膜未见异常。N组:心肌间质轻度增大、水肿，心肌内层、心壁内可见点状心肌坏死，局部伴少量单核细胞及淋巴细胞浸润，心内膜和心外膜未见异常。P组:心肌间质增大、水肿较SHR组减轻，心肌内层可见点状或微小心肌坏死，坏死灶较SHR组及N组减轻，局部无明显单核细胞及淋巴细胞浸润，心内膜和心外膜未见异常。见图1。

2.4 免疫组化结果 各组大鼠心肌细胞质中均可见eNOS阳性信号表达，其中SHR组着色强度较浅，呈淡黄褐色，P组着色强度最深，呈棕黄色。通过灰度扫描计算，N组着色强度〔(16.5±2.8)%〕略高于SHR组〔(14.3±2.4)%〕，与SHR组相比，差异没有统计学意义(P＞0.05);P组〔(38.4±4.2)%〕大鼠心肌eNOS表达高于SHR组及N组，差异具有统计学意义(P＜0.01)。见图2。

图1 心肌光镜观察结果(HE，×200)

图2 心肌eNOS免疫组化结果(DAB，×200)

3 讨论

近年来认为高血压是代谢综合征(MS)的重要组成部分，与胰岛素抵抗有直接关系。许多研究表明高血压人群约60%伴有胰岛素抵抗，同时提示高胰岛素血症是导致高血压的重要原因〔1，2〕。笔者先前的研究工作发现吡格列酮配合生活方式干预有很好的降低SHR大鼠血压的作用，可能是通过减轻胰岛素抵抗、增加胰岛素敏感性来发挥降压机制，同时这种治疗组合方法可较好的调整糖脂代谢，血管壁保护作用强，可减轻动脉硬化发生的危险因素〔3～5〕。胰岛素增敏剂配合生活方式干预的综合治疗措施可作为纠正胰岛素抵抗的方法应用到存在胰岛素抵抗的原发性高血压的治疗当中。

血管内皮细胞是人体最大的内分泌、旁分泌器官，能分泌几十种血管活性物质，NO就是其中之一。血管内皮也是高血压形成和发展过程中重要的靶组织，与高血压有密切的关系。高血压可以导致并加重血管内皮功能障碍，而血管内皮细胞功能受损反过来又能加剧血压的增高〔6，7〕。NO信号系统的健全又是内皮细胞发挥生理作用的关键，血管内皮细胞分泌的NO是由eNOS经多步氧化还原反应生成的，NO是调节血管基础张力和血压的重要因子，是迄今所知最强的内源性血管舒张因子。体内eNOS受遗传和环境因素的调节，其活性需多种因素的参与和调控，在多种心血管疾病中发现eNOS基因表达发生改变〔8〕，已有学者将eNOS作为心血管疾病基因治疗的首选酶〔9〕。研究证明eNOS活性降低，NO生成减少是血压升高的重要原因〔10～12〕。本研究显示，P组大鼠血清中eNOS含量最高，提示吡格列酮配合生活方式干预可以通过升高血液中eNOS含量，恢复eNOS生物学功能并减轻氧化应激，发挥降压及心血管系统保护作用。

光镜下心肌形态学观察显示各组大鼠心肌HE染色心内膜和心外膜未见明显异常，心肌间质均有不同程度的增大、水肿，心肌内层可见小灶状心肌坏死，单核细胞及淋巴细胞浸润程度也不同。心肌形态学病理改变以SHR组及N组程度最重，P组病理改变最轻，而且无明显单核细胞及淋巴细胞浸润，可见高血压可导致左室向心性肥厚。SHR大鼠心肌间质水肿，轻度坏死并出现代偿性损伤的改变，是左室心功能受损的形态学基础。吡格列酮配合生活方式干预可明显抑制高血压引起的心肌间质增大及水肿，减轻心肌内层的微小心肌坏死及单核细胞、淋巴细胞浸润，发挥了良好的心脏保护作用，并且效果明显好于硝苯地平。

硝苯地平是一种短效钙离子拮抗剂，为二氢吡啶类化合物，在本实验中置于大鼠饮水中供24 h饮用。结果发现硝苯地平对心肌也有一定的保护作用，支持国外的研究结果〔13〕。钙拮抗剂对高血压心血管系统的保护作用主要是通过减轻细胞内的Ca2+超载，抑制心肌纤维的过度收缩，减少能量消耗和溶酶体酶系的活性。近年来的研究发现硝苯地平也还具有增加NO活性、减轻自由基损伤、保护血管内皮功能等方面的作用，从而对心血管系统产生较好的保护作用〔14〕，有关研究结果巩固了钙拮抗剂类降压药物的核心地位。

心肌eNOS免疫组化结果显示，各组大鼠心肌细胞质中可见eNOS阳性信号表达，强度有所不同，以SHR组及N组最弱，P组最强。通过灰度扫描计算，P组心肌eNOS表达均明显高于SHR组及N组。可以看出，高血压时，心肌eNOS可有一定程度的表达，提示在损伤因素存在时，机体有一定的保护能力，eNOS呈代偿性增高，但增高的程度有限，不足以对抗损伤因素，导致靶器官持续受损。硝苯地平治疗后可以提高心肌eNOS表达，但与SHR组相比无明显差异。分析原因可能为硝苯地平是短效钙拮抗剂，实验发现其降压迅速有效，开始时即能对SHR大鼠血压增长有良好的控制，但缺乏持久性，实验后期其治疗组血压有回升趋势，eNOS保护作用下降，心肌呈低表达状态。应用吡格列酮配合生活方式干预治疗的SHR大鼠，心肌eNOS免疫组化呈强阳性表达，提示胰岛素增敏剂配合生活方式干预具有很好的心肌保护作用。这种综合干预措施显著地对高血压所致的心脏结构和功能均有较好的保护作用，避免或减轻SHR大鼠的靶器官受损。

降压药物的心血管系统保护作用至关重要，只有具备这种保护作用的降压药物才有临床应用价值及进一步研究的前景，才有可能被广泛应用来降低高血压患者心血管并发症的发病率。近些年来国内外开始关注噻唑烷二酮类药物(TZDs)降压作用和心血管系统保护作用的研究，国内外有关TZDs心血管系统保护作用机制的研究显示〔15～17〕，TZDs作为人工合成的过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR-γ)的激动剂，可以明显缓解胰岛素抵抗和平抑高胰岛素血症，抑制平滑肌细胞的增殖和迁移，抑制巨噬细胞产生的炎症因子，避免氧化损伤，抑制Ca2+通道活性，从而保护内皮细胞的形态与功能，减轻平滑肌细胞的增殖以及胶原组织在血管壁的堆集。这些研究结果均可揭示胰岛素抵抗在高血压心血管系统并发症的形成和发展过程中的重要病理基础，因此应用有纠正胰岛素抵抗作用的药物进行对高血压靶器官保护作用的研究，对高血压发病机制的完善也有着深远的意义。本实验从形态学上及免疫组织化学的角度发现应用吡格列酮配合生活方式干预的搭配方法在取得良好降压效果的同时还具有心肌保护作用，这种抑制靶器官受损的作用是今后对TZDs研究的重点。

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