张 静 连超群 陈传好 胡明洁 吴守伟

(蚌埠医学院生物科学系遗传教研室，安徽 蚌埠 233030)

传统的肺癌化疗常因严重损害人体正常组织细胞而使临床应用受到限制，寻找毒性低、副作用小的治疗药物成为近年来肿瘤基础和临床研究的热点。姜黄素(Curcumin)是从我国传统中药姜科植物姜黄的根茎中提取的有效成分，具有抗炎、抗氧化和降血脂等多种药理作用〔1，2〕。近年来研究发现，姜黄素可能是一种有开发前景的天然抗癌新药，其在体外对多种肿瘤细胞具有抑制增殖、诱导凋亡的作用，而对正常组织细胞几乎无毒性〔3，4〕。本研究以人肺腺癌细胞系A549为研究对象，通过检测姜黄素对体外培养肿瘤细胞凋亡的影响和细胞内活性氧(ROS)水平和半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)的变化，探索姜黄素对肿瘤细胞的作用及其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 人肺腺癌细胞系A549购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库。小牛血清为杭州四季青公司产品，RPMI 1640购自 Gibco公司，二甲基亚砜(DMSO)、噻唑蓝(MTT)、Hoechst 33258购自Sigma公司。姜黄素购于美国Sigma公司，以少量DMSO溶解姜黄素粉剂，配成10 mmol/L贮存液，－20℃保存，临用时以完全培养液稀释至所需浓度。caspase-3活性检测试剂盒购自北京碧云天生物科技有限公司，ROS探针2，7-二氯荧光乙酰乙酸盐(2，7-dichlo-ro fluorescein diacetate，DCFH-DA)购自Molecular Probes公司，余为国产分析纯试剂。

1.2 方法

1.2.1 人肺癌A549细胞培养 人肺癌A549细胞株用含10%小牛血清的RPMI1640培养液，在5%CO2、37℃培养，细胞呈贴壁生长，用0.25%胰酶消化传代，用于实验的细胞均处于对数生长期。

1.2.2 细胞增殖抑制实验 取对数生长期的A549细胞，调整细胞浓度为2×104个/ml，按每孔2 000个接种于96孔板，每孔100μl。37℃、5%CO2培养箱中培养24 h，以姜黄素终浓度为5、10、20、40、80 μmol/L 处理细胞。每个浓度设6 个平行孔，并同时设阴性对照和空白对照，分别于作用12、24、36、48 h后每孔加入50 mg/L MTT溶液20μl，37℃孵育4 h后，终止培养，小心吸去上清，每孔加入150μl DMSO，振荡器震荡10 min，完全溶解结晶，酶标仪在570 nm处测量各孔吸光度(A)值，按以下公式计算细胞增殖抑制率(%)=(对照组平均A570值－给药组平均A570值)/对照组平均A570值×100。

1.2.3 Hoechst 33258染色观察细胞凋亡 将对数生长期A549细胞以3×105个/ml接种于35 mm Petri培养皿底中间的圆形凹槽里，待24 h贴壁后，分组进行药物处理，分对照组和姜黄素实验组，对照组只加培养液和细胞，实验组分别加入5、10、20、40、80μmol/L的姜黄素。作用 48 h后弃培养基，4%多聚甲醛4℃固定10 min，磷酸盐缓冲液(PBS)洗2次，加10μg/ml的Hoechst 33258染色液于避光染色15 min，PBS漂洗。利用激光共聚焦扫描显微镜检测分析，激发波长为405 nm，吸收波长为(450±15)nm。

1.2.4 细胞内ROS水平测定 细胞处理方式以及给药方法同1.2.3项，药物作用48 h后吸出培养皿中的培养液，用PBS洗涤2～3次后，加入DCFH-DA液，使终浓度为10μmol/L，在37℃、5%CO2培养箱内避光培育20 min，吸除染液，用PBS洗涤3次，利用激光共聚焦扫描显微镜检测其荧光强度，分析ROS水平，激发波长为488 nm，吸收波长为(590±50)nm。

1.2.5 caspase-3活力检测 将对数生长期A549细胞以3×105个/ml接种于6孔培养板培养24 h后，分组进行药物处理，药物处理同 1.2.3项，药物作用 48 h后，收集细胞，按照100μl/200万个细胞的比例加入裂解液，冰浴裂解15 min。4℃，1 2000 r/min离心15 min，把上清转移到冰浴预冷的离心管中，置于冰上;按试剂盒说明进行操作，使用酶标仪在405 nm测定caspase-3的酶活性，OD405即为样品中caspase-3催化产生的pNA(p-nitroaniline)产生的吸光度，其值大小反映caspase-3活性强弱。

1.3 统计学分析 应用SPSS11.0统计软件进行处理，数据以x±s表示。各组间采用单因素方差分析对所得实验数据进行统计学分析。

2 结果

2.1 姜黄素对A549细胞增殖的抑制作用 姜黄素对人肺腺癌细胞系A549细胞生长具有抑制作用，且呈现浓度和时间依赖关系。在同一浓度作用下，姜黄素实验组的细胞生长抑制率随作用时间的延长而增大。在同一处理时间，随着姜黄素浓度的增加，除了5μmol/L的姜黄素作用12 h外，其余各实验组与对照组比较细胞抑制率的差异均有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01)。5～80μmol/L的姜黄素对A549细胞作用48 h时抑制效果最佳，最大抑制率达80.60%。见表1。

2.2 姜黄素诱导A549细胞凋亡的形态学变化 Hoechst 33258荧光染色照片显示，阴性对照组细胞核膜完整，核呈圆形或椭圆形，染色质分布较均匀，细胞核为蓝色均匀淡染。不同浓度姜黄素作用A549细胞48 h后，部分细胞出现核体积变小，核固缩，细胞核出现碎裂，呈现致密的蓝色颗粒状荧光，表现为典型的凋亡形态学改变，表明姜黄素对A549细胞的增殖抑制可能与细胞凋亡有关。见图1。

2.3 姜黄素对A549细胞ROS的影响 以荧光强度反映ROS水平。阴性对照组荧光强度较微弱，ROS最低，姜黄素处理A549细胞48 h后胞内ROS浓度增加，具有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01)，并且ROS随姜黄素剂量的增加而升高，呈一定的剂量依赖关系。见表2。

2.4 姜黄素对A549细胞caspase-3活性的影响 以OD405反映caspase-3活性强弱。经不同浓度姜黄素作用48 h后的A549细胞内caspase-3活性均较阴性对照组增强，与阴性对照组相比，除5μmol/L姜黄素实验组外，其余各浓度实验组差异均有统计学意义(P＜0.01)。见表2。

图1 Hoechst33258荧光染色姜黄素对A549细胞核形态的影响(×400)

表1 姜黄素对A549细胞抑制率的影响(x ±s，n=3，%)

表2 姜黄素对A549细胞ROS及caspase-3影响(x ± s，n=3)

3 讨论

细胞凋亡作为一种基本的生命现象，在维持机体自身稳定中起重要作用，不仅在正常的组织中存在，在肿瘤组织中亦广泛存在。研究发现肿瘤的发生、发展及产生耐药与细胞凋亡有密切关系〔5〕。使用能够促进肿瘤细胞凋亡、抑制其生长的抗癌药物是目前肿瘤治疗的主要手段之一。姜黄素是从姜黄、郁金、莪术、菖蒲等传统中药根茎中提取的一种植物多酚，可抑制多种肿瘤细胞生长、诱导凋亡、抑制转移和提高肿瘤细胞化疗敏感性。由于其明显的广谱抗肿瘤活性，美国国立肿瘤研究所已将其列为第3代癌化学预防药〔6〕。本研究显示，姜黄素对体外培养的人肺腺癌细胞A549增殖有明显的抑制作用，并且表现出明显的剂量和时间双重依赖性(P＜0.05)。A549细胞在姜黄素的作用下出现胞体变小、核固缩、破碎等典型的细胞凋亡形态学特征。

研究表明氧化应激参与了细胞凋亡的过程，并起了关键作用。ROS是细胞有氧呼吸过程中产生的O2代谢产物及其衍生的含氧物质的统称，包括所有的含氧自由基和过氧化物。ROS在凋亡中的作用日益受到重视，很多证据提示在促凋亡信号作用下ROS的升高可能作为第二信使上调促凋亡蛋白表达，促进线粒体通透性转变孔的开放，激活天冬氨酸特异的caspase，参与Ca2+途径等，诱导细胞凋亡。同时ROS的水平可能通过影响caspase的活性和三磷酸腺苷水平决定细胞对促凋亡信号的效应，或凋亡或坏死，或耐受。很多抗肿瘤药物诱导肿瘤细胞DNA片段化并诱导凋亡均与引发ROS改变相关〔7，8〕。研究表明姜黄素具有调节ROS的作用，Bhaumik等〔9〕发现姜黄素能促使BC-8〔激酶基因内含子5(AK-5的单细胞克隆)〕细胞的细胞膜发生功能和结构变化，导致早老蛋白(PS)残基外显，促进自由基的释放，且有助于细胞外的ROS进入细胞发挥活性。本实验应用荧光染料 DCFH-DA检测细胞内ROS的变化，DCFH-DA可自由扩散进入细胞后被酯酶催化变成DCFH，在ROS存在下被氧化成DCF，DCF在一定波长激发光激发后产生绿色荧光，绿色荧光强度的高低与ROS浓度成正比。研究结果显示人肺腺癌A549细胞在不同浓度姜黄素的作用下，其细胞内荧光强度显著升高，表明姜黄素的作用可促使细胞ROS水平显著升高，且随姜黄素剂量的增加而升高。说明氧化应激参与姜黄素诱导A549细胞凋亡过程，ROS的增多可激活多种凋亡途径，尤其在线粒体凋亡途径中扮演重要的角色，从而诱导A549细胞凋亡。

caspase是存在于哺乳动物细胞中的一组蛋白酶家族，在细胞凋亡过程中起重要作用。caspase一经激活，将产生级联反应，最终导致细胞凋亡。caspase-3是caspase家族成员中执行细胞凋亡的关键蛋白酶，被激活后裂解产生17 kD的活性亚单位发挥作用，参与caspase的两条不同激活途径(死亡受体-caspase-8和细胞色素C-caspase-9酶原激活途径)。研究表明姜黄素的抗肿瘤作用可能与caspase的激活有关，孙阳〔10〕研究发现姜黄素明显抑制人脑胶质瘤细胞(SHG-44)的增殖，诱导SHG-44细胞凋亡，caspase-3活性增强，各种caspase抑制剂可抑制姜黄素诱导的SHG-44细胞凋亡。Khar等〔11〕报道，姜黄素诱导AK-5细胞凋亡过程中，caspase-3活性明显增高，且通过caspase-3抑制剂(DEVD)的抗凋亡作用及Western印迹得到证实，表明caspase-3参与姜黄素的诱导凋亡过程。本研究结果显示姜黄素各浓度实验组的caspase-3活性均明显升高，并具有浓度依赖性。表明姜黄素诱导A549细胞凋亡过程中存在caspase-3的活化，提示姜黄素可能通过激活 caspase-3诱导A549细胞凋亡。

综上所述，姜黄素可能通过ROS水平的升高激活caspase-3从而诱导A549细胞凋亡。然而凋亡是一个非常复杂的过程，姜黄素究竟通过那条信号途径诱导A549细胞凋亡仍有待深入研究。

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9 Bhaumik S，Anjum R，Rangaraj N，et al.Curcumin mediated apoptosis in AK-5 tumor cells involves the production of reactive oxygen intermediates〔J〕.FEBSLett，1999;456(2):311-4.

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11 Khar A，Ali AM，Pardhasaradhi BV，et al.Antitumor activity of curcumin is mediated through the induction of apoptosis in AK-5 tumor cells〔J〕.FEBSLett，1999;445(1):165-8.