吴敏霞 许 盈 胡祥炬 林 曦

(福建医科大学基础医学院病理学系电镜室，福建 福州 350004)

过度磷酸化的tau蛋白可引起微管生成障碍，导致轴浆流中断，轴索运输失常，进而引起神经细胞的死亡。课题组前期的研究也证明冈田酸(OA)作用于人神经母细胞瘤(SH-SY5Y)细胞导致细胞tau蛋白过度磷酸化，与阿尔茨海默病(AD)病人脑组织中的病理特征一致，可作为研究AD的细胞模型〔1〕。在此基础上，本实验拟从超微水平揭示AD脑中tau蛋白过度磷酸化导致的微管结构破坏与神经元退变的因果关系。

1 材料与方法

1.1 试剂与细胞 OA，Sigma公司产品，用二甲基亚砜(DMSO)配成20μmol/L的母液，分装备用。胎牛血清，杭州四季青生物工程公司产品。1640培养液，Gibco公司产品。其他试剂均为国产分析纯。SH-SY5Y细胞，福建医科大学药学院药理学系赠送。CO2培养箱，SHEL LAB公司;倒置相差显微镜，Olympic公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 SH-SY5Y细胞用含15%胎牛血清的RPMI1640培养液，置于5%CO2、37℃培养箱中培养，用0.25%胰蛋白酶消化单层培养细胞，待细胞间隙变得较明显，细胞突起有所回收时终止消化，RPMI1640培养液吹打成单个细胞悬液，3～4 d传代一次，取对数生长期的细胞用于实验。

1.2.2 四甲基偶氮唑盐(MTT)法 以每孔1×104细胞数接种于96孔板，96孔板内的细胞分别每孔加入10，20，40 nmol/L蛋白磷酸酯酶(PP)-2A和-1抑制剂OA的1640培养液(含2.5%胎牛血清)100 μl，每种浓度4 孔，培养6，12，24，48，72 h。实验结束后，每孔加入MTT溶液(5 mg/ml)10μl，37℃，继续孵育4 h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入150μl DMSO，振荡10 min，溶解生成的深蓝色结晶，选择波长490 nm，在BIO-RAD Model 450酶标仪测OD490 nm值，作为反映细胞代谢状况的参数。

1.2.3 光学显微镜观察 接种细胞如MTT法，然后用倒置相差显微镜进行观察、摄片。……