左文斌 潘 辉 李莲瑞

干扰素(IFN－γ)是具有正常生理功能的细胞在适宜的诱生剂的作用下产生的能够抑制病毒增殖的一类重要细胞因子，其化学本质是一种糖蛋白，具有广谱抗病毒、抗细胞分裂增殖及免疫调节等多种生物学功能［1］。干扰素具有抑制细胞增生、免疫调节及抗炎症活性，因而对宿主防御机制很重要。

随着病原菌新毒株、变异株的不断出现，我国动物疾病的防治面临严峻的挑战。自发现干扰素以来，干扰素已经显示出极强的抗病毒、抗肿瘤以及免疫调节活性和应用前景，干扰素的研究越来越受到人们的广泛关注［2］。目前干扰素在基础理论和实践应用上仍需要进行大量的研究，通过对多浪羊IFN－γ基因的克隆与序列分析，能够为多浪羊IFN－γ的功能研究和免疫应答相关基因的筛选奠定基础，为IFN－γ基因工程药物的生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

多浪羊由塔里木大学动物科学学院提供;DH5α感受态细胞本实验室制作保存;Trizol Reagent购自Invitrogen公司;RT－PCR试剂盒、pMD18－T载体、DL2000 DNA Marker、限制性内切酶EcoR I和Xho I购自大连宝生物工程有限公司;DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自杭州爱思进生物技术有限公司;其它试剂由本实验室配制。

1.2 方法

1.2.1 总 RNA 提取

无菌采集多浪羊羊外周血20 mL，加入3.8%枸橼酸钠抗凝。然后参照贺艳艳［3］等分离淋巴细胞的方法，分离淋巴细胞。按Invitrogen Trizol试剂说明书提取总RNA，置于－70℃保存备用。

1.2.2 引物设计

根据 GenBank上的 IFN－γ基因序列 NM_001009803设计引物:

上游引物为 5’－GGCCTCGAGAGGCAGGAGAACCATTAC －3’，

下游引物为5’－GGCGAATTCCACAGGAGCTACCGATTT －3’。

1.2.3 两步法扩增IFN－γ基因