晋志高，何原芳，景向红

(1.煤炭总医院，北京 100028;2.中国中医科学院针灸研究所，北京 100700)

糖尿病(diabetesmellitus，DM)是常见的内分泌代谢性疾病，可引起血管功能和结构的损伤，导致血流的改变而加重脑缺血，由此导致学习记忆障碍。本研究拟采用CREB为切入点，观察针刺对糖尿病大鼠海马和杏仁复合体内CREB表达的影响，为糖尿病脑病的研究和治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 动物

Wister大鼠(雄性1个月龄)36只，体重180g±15g。

1.2 建立动物模型

1.2.1 学习和记忆能力训练 隐藏平台获得实验:实验前动物自由游泳2min。正式实验每天训练4次，即由起点处将动物放入书中，游至终点经平台出水为止。每次180s，随机从东、西、南、北4个入水点选择1个，将动物面向池壁放入水中，记录动物寻找并爬上平台所需时间即逃避潜伏期(escape latency)。

空间搜索实验:用于测量动物对平台空间位置准确记忆，即记忆保持能力。测量180s内:(1)动物在目标象限(原平台所在象限)(target quadrant)和其他各象限的游泳时间;(2)动物在目标象限和其他各象限游泳路径的长短。每次记录潜伏期，即由入水到开始游泳的时间;运动时间，即由起点游到终点的时间;错误的次数，既改变游泳的方向或进入盲端的次数。每只动物共计训练28次，实验历时7 d。计算每天各组动物4次逃避潜伏期的平均值。平均运行时间;正确率 (正确数/训练次数)。最后以平均潜伏期小于5 s，平均运行时间小于15 s，正确率大于90%作为标准，判定是否建立了空间辨别性学习记忆模型。

1.2.2 DM学习记忆障碍模型的建立 试剂:链脲佐菌素(STZ，Sigma公司)，临用前以无菌枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液配制 pH=4.2，浓度为25mg/ml的工作液。美国 Ames公司 Glucometer3微量血糖测定仪和血糖试纸检测。确定学习和记忆能力训练成功后，36只大鼠随机分为正常对照组(NC，9只)和模型组(27只)，模型组大鼠禁食10h，按50mg/kg剂量向大鼠腹腔内注入25mg/ml浓度的 STZ，注药后48h测血糖，血糖连续2次超过168mmol/L并稳定5d者选为糖尿病模型。

表1、2显示，造模后第18天做行为学检测，结果显示DM模型组在目标象限停留时间百分比短，游距离的百分比也短，与正常组的游泳时间百分比及游泳距离百分比比较有显著差异，说明糖尿病组动物存在明显的空间学习记忆障碍。

24只动物经行为学测定被确认为学习记忆障碍，再将动物随机分为模型组(DM)、针刺组(AP)、BDNF治疗组(BD)3组，每组8只。

表1 治疗前正常组与模型组游泳时间比较

表2 治疗前正常组与模型组游泳距离比较

1.3 针灸及BDNF治疗

1.3.1 针刺治疗 被确认为学习记忆障碍后当天开始治疗，针刺治疗从调督脉入手，因督脉为阳脉之海，总督一身之阳。刺激督脉，可振奋一身之阳，促进生长发育;督脉络肾入脑，刺督脉可补髓益脑，改善智力。选取督脉的“百会”、“大椎”，电针治疗(2Hz，3mA)，留针 20min，隔日 1 次，共治疗 10次。

1.3.2 BDNF治疗 动物椎管内腔注射BDNF(10ug/kg体重，生理盐水溶液)，第1周2次，共2次。

正常组和模型组动物与前2组动物在相同条件下饲养，不进行任何治疗。

1.4 免疫组织化学实验

动物治疗3周后，再做行为学检测，检测后，3组动物均经1%戊巴比妥钠(40mg/Kg体重)腹腔麻醉后，行常规心脏灌流固定。

1.4.1 取材 剪开前胸壁，纵形剪开心包，充分暴露心脏。0.2 ul肝素钠抗凝，在心端左处的左心室插管至升主动脉，止血钳将心脏与针头固定，剪开右心耳，快速滴入室温下的生理盐水约定100ml冲洗。续用4℃的4%多聚甲醛(0.1BMP配制，pH=7.4)150ml～200ml灌注固定，先快后慢，40min灌完后立即开颅取脑。4℃冰箱过夜至组织块沉底。

1.4.2 切片 对端脑做额状面冰冻切片，组织于恒冷箱机切片机内行连续冠状切片，片厚30μm，每隔2片取2片，裱片于预涂硌钒明胶的载玻片上，晾干后分为2套，用于免疫组织化学检测。

1.4.3 免疫组化染色法(一抗为 BDNF，CREB)(1)切片经蒸馏水冲洗，PBS浸泡5min;(2)滴加试剂 A(蓝色液体)，室温孵育 10min～15min，倾去勿洗;(3)滴加适当比例稀释的一抗，室温孵育24h;(4)PBS冲洗3min/次，3次;(5)滴加试剂B(黄色液体)室温或37℃孵育10min～15min，过夜12h;(6)PBS冲洗，3min/次，3次;(7)DAB显色，避光、显色10min～30min，肉眼观察;(8)自来水充分水洗;(9)脱水、透明、树胶封片。

普通光学显微镜下观察各组动物海马、杏仁核及扣带回等区的阳性表达情况。阳性标记物为棕褐色，用MIS2000图像分析系统进行标记细胞书的测定及积分光密度测定。

1.5 统计学方法

实验数据以均值±标准差(Mean±SD)表示，组间差异采用ANOVA进行统计分析。

2 结果

2.1 治疗后各组行为学检测结果

Morris水迷宫实验检测大鼠空间学习记忆能力，在隐藏平台获得实验中，各组动物的逃避潜伏期均随游泳次数增多而减少，波形呈锯齿状，说明动物对前次的学习有遗忘。第8天撤除目标象限台子，进行空间搜索实验，计算大鼠在目标象限停留时间百分比和所游距离的百分比，用来检测记忆力保持能力。结果显示，DM模型组游泳距离的百分比也最短(19.55±3.47%)，在目标象限停留时间百分比最短(26.77±3.56%)，说明糖尿病组动物存在明显的空间学习记忆障碍，针刺治疗后动物在目标象限停留时间(34.44±5.48%)和所游的距离(24.69±4.37%)明显优于 DM 模型组(表 3、4)，其P值均小于0.05。

2.2 免疫组织化学结果

表3 各组动物治疗后游泳距离(百分比)比较

表4 治疗后游泳时间百分比

CREB免疫组化阳性标记细胞分布于广泛的脑部区域，标记细胞胞浆内充满棕黄色的阳性反应颗粒，胞核不着色，海马区域的标记神经元最多(图1)，着色最深，体积为中等大小最多，形状均为圆形，树突无染色。表5显示，4组海马阳性标记物细胞比较，正常组 NC最高，ACP组次之，BD组再次之，DM组最低，前3组与DM组比较有显著性差异(P<0.05)。标记物光密度比较，正常组 NC最高，ACP组次之，BD组再次之，DM组最低，前3组与DM组比较有显著性差异(P<0.05)。表6显示，杏仁核的CREB阳性标记物与海马区域数量较少，标记也较浅，标记物光密度比较，正常组 NC最高，ACP组次之，BD组再次之，DM组最低，前3组与DM组比较有显著性差异(P<0.05)。

图1 海马出现CREB阳性表达的神经元。NC:正常组，AP:针灸治疗组，BD:BDNF治疗组，DM:糖尿病模型对照组

3 讨论

糖尿病(diabetesmellitus，DM)是常见的内分泌代谢性疾病。流行病学研究结果显示，老年性痴呆与2型糖尿病的发病率均呈现逐年上升态势，二者具有明显相关性[1、2]。DM引起的脑功能障碍是一个多因素的病理过程，可引起血管功能和结构的损伤，导致血流的改变而加重脑缺血，增加中风的死亡率，对由此导致的学习记忆障碍也没有很好的治疗方法。以往的研究表明，针刺疗法对糖尿病神经病变和脑缺血都具有良好的疗效[3]，与针刺能改善微循环、缓解组织缺氧有关，调节海马内神经生长因子的表达，也与针刺能够直接或间接地影响中枢神经系统、内分泌系统及周围神经系统有关[4，5];针灸结合减量西药可以较理想地控制2型糖尿病患者的血糖、血脂，既减少了药物带来的副反应，又可以预防血管病变引发的并发症的发生，因而得到广泛的临床应用，但其作用机制有待进一步探讨。

表5 治疗后各组海马CREB阳性标记物光密度值比较

表6 治疗后各组杏仁核CREB阳性标记物管密度值比较

CREB(环磷腺苷反应元件结合蛋白)是转录因子家族中的一员。CREB磷酸化后调控神经营养因子的表达及其诱导的基因转录，增加转录速度，改变基因表达在各种应激性脑损伤，通过表达有效存活因子，在组织细胞修复、再生中起重要作用。CREB也具有调节包括学习记忆在内的广泛的生物学功能[6]，是细胞内多种信号通路的一种关键成分。目前大量研究已表明，细胞内构成长期记忆的变化需要依赖CREB的转录，CREB是长期记忆形成过程所必需的一种关键的调节分子。学习记忆行为训练前向大鼠海马内注入CREB的反义寡核苷酸可导致其在Morris水迷宫中的空间学习缺陷，而训练前双侧穹隆海马伞被切断的大鼠，也可因海马CREB的水平不能升高而致逃避性记忆受损。Nagakura等[7]发现，痴呆大鼠在水迷宫训练后逃避潜伏期延长，海马等脑区的 CREB的含量有所下降。Herdegen等[8]用免疫组化方法观察了大鼠大脑皮层中包括CREB在内的多种转录因子的表达，发现CREB与早期基因(immediate-early genes，IEGs)的编码的核蛋白不同:IEGs受刺激诱导可以快速表达合成出新的蛋白发挥转录因子或转录调节因子的作用，而CREB受刺激后并无新的合成，只需要通过活化原有的CREB发挥作用。细胞内CREB有2种存在形式:单体和二聚体，CREB二聚体的 DNA亲和力与转录活性均明显高于单体，其间可以相互转化。CREB二聚体又依其磷酸化程度分为无磷酸化、半磷酸化和磷酸化的二聚体。第1种与内源CRE亲和力较低，无转录活性;第2种有一定DNA结合活性，但转录调节活性很低;只有第3种的亲和力和转录活性作用均较高，所以一般认为，前2种为CREB的无活性形式，而第3种为 CREB的活性形式[8]。由此不难推测，磷酸化与脱磷酸化是调节CREB活性的重要机制之一。目前，研究最多CREB磷酸化的蛋白激酶是 PKA，它可使 CREB的 Ser-133位磷酸化。PKA-CREB信号转导通路在中枢神经系统中起着关键的作用，能促进神经细胞的存活、再生和分化。实验证明，PKA-CREB信号传导通路与突触的可朔性及学习记忆功能有密切的关系[9]。我们也观察到，DM学习记忆障碍模型大鼠海马及杏仁核内CREB表达降低，针刺可使其升高。我们的结果显示，CREB免疫组化阳性标记神经元的体积比BDNF阳性标记细胞小，海马区域的标记神经元最多，着色最深，体积也为中等大小最多，形状均为圆形，树突无染色，在阳性标记物细胞数量上ACP组与DM组比较有显著性差异，标记物光密度比较有显著性差异，证实海马和杏仁核参与了针刺调节CREB的表达。

近年来发现，蛋白激酶A-cAMP反应元件结合蛋白(protein kinase A-cAMP reponse elment binding protein，PKA-CREB)信号转导通路在中枢神经系统中起着关键的作用，能促进神经细胞的存活、再生和分化。实验证明，PKA-CREB信号转导通路与突触的可朔性及学习记忆功能有密切的关系[10]。随着脑缺血分子机制的深入研究，发现急性脑缺血可以激活内源性保护机制PKA-CREB信号转导通路。CREB被认为是在开启从短时记忆到长时记忆的关键，所以可能与改善记忆力的缺乏及认知有关系。在年长的动物大脑海马内CREB经磷酸化后，即磷酸化CREB的活动水平明显低于年轻组的动物，而在大脑受损的年长动物的CREB活动可能提示与空间工作记忆缺乏有关。而缺血缺氧性损伤可引起海马亚区不同形式的细胞死亡。其表现为CA1细胞凋亡，CREB磷酸化丢失。CA3区 及齿状回颗粒细胞不发生改变，伴随CREB磷酸化增强并且先于细胞死亡的发。这些证据表明CREB的活化对海马神经元的存活起重要作用。

针灸治疗消渴病最早见于淳于意的诊籍《史记·扁鹊仓公列传》:“齐章武里曹山跗病，臣意诊其脉曰:‘肺消瘅也，死不治。所以知山跗病之府者，臣意切其脉，肺气热也。臣意未往诊时，齐太医先诊山跗病，炙其足少阴脉口;又灸其少阴脉，而饮之半夏丸。”这是最早循经脉用以灸法治疗消渴病的病案记录。晋·皇甫謐的《针灸甲乙经》记录了大量具有治疗消渴病主要症状的腧穴，如腕骨、意舍、然谷、承浆，太溪主治“消渴”、“消瘅”;鱼际、少商、曲池、隐白、劳宫、中封、太冲、行间等治疗消渴病以渴或嗜饮为主的症状，而治疗消渴病热中消谷善饥主要选取足三里，指出足三里主“消中”。《甲乙经》卷七第一下:“邪在脾胃，则病肌肉痛。阳气有余，阴气不足，则热中善饥，三里主之。”20世纪50年代开始针刺治疗糖尿病出现了个案报道，随后在60年代出现大样本的病历观察和分析，在80年代多以针刺治疗糖尿病并发症和针刺作用机理为研究的重点。针刺治疗可以促进脑内源性BDNF蛋白的合成，可能也是针刺有效治疗缺血性脑损伤的机制之一。王俊英等[11]观察用电针镇痛的累积效应与大鼠下丘脑、海马蛋白激酶A表达的变化，推测电针镇痛的积效应可能与下丘脑、海马细胞PKA的表达上调有关，并且与动物神经记忆有密切关系。电针能有效地逆转抑郁大鼠海马PKA、PKC的阳性表达。认为电针对治疗抑郁可能是通过调节海马细胞信号转导通路相关酶的功能而实现的。

本文的研究结果证实，DM学习记忆障碍模型大鼠海马及杏仁核内CREB表达降低，针刺可使其升高。针刺可能通过调节PKA-CREB信号通路促进BDNF的合成及分泌，促进神经细胞再生功能，从而可影响学习与记忆。这可能是针刺治疗老年痴呆的神经机制。

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