方肇勤，管冬元，潘志强，卢文丽，苟 薇，丁善萍，张园园，王艳明

(上海中医药大学，上海 201203)

中药药性主要指中药的寒热温凉特性，亦称四气，是中医对复杂中药药效的高度概括，是临床遣方用药的依据，也是中药的特色和标志。当前，在中药研发中突出的问题之一是难以评价中药的药性。长期以来，由于缺乏中药药性标准化的检测方法，带来了系列学术问题，诸如一些常用中药历代药性描述存在分歧，许多民间草药、地方草药缺少药性的记载，中药活性成分、有效成分组群、药效物质等难以明确其药性等等，限制了中药学的发展。因此，探索和建立标准化的中药药性检测方法，已成为当代中医药的关键科学问题和重大基础问题。最近，我们在大鼠和小鼠标准化诊法和辨证方法建立的基础上，综合采用不同大鼠和小鼠模型，比较和观察了一些代表性的中药、中药复方、中药有效成分给药后对被试动物证候的影响，探索和发展中药药性实验检测方法学，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 主要材料

1.1.1 动物 雄性昆明种小鼠、雄性Wistar大鼠。

1.1.2 药物 (1)中药饮片:黄柏、栀子、苦参、生晒参、制附子、知母、生大黄、生黄芪、淫羊藿、制吴茱萸;(2)中药复方:黄连解毒汤、疗本滋肾丸、大黄附子汤、左金丸、参附汤、吴茱萸汤;(3)中药有效成分:小檗碱、大黄酚、大黄素、栀子苷、知母皂苷、淫羊藿苷、乌头碱。

1.1.3 大鼠和小鼠诊法工作站 参考有关文献[1、2]。

1.2 主要方法

1.2.1 不同证候造模 依据有关文献[3、4]，分别采用酵母发热大鼠造模、优甲乐内热小鼠造模、环磷酰胺虚寒小鼠造模等。

1.2.2 实验分批进行 (1)不同中药饮片及复方连续给药3 d后对正常小鼠证候影响的观察;(2)不同中药饮片及复方一次性给药2 h后对优甲乐内热造模小鼠证候影响的观察;(3)不同中药饮片及复方一次性给药3 h后对酵母发热造模大鼠证候影响的观察;(4)不同中药饮片及复方连续给药3 d后对环磷酰胺虚寒造模小鼠证候影响的观察;(5)中药有效成分及对应中药饮片一次性给药2 h后对优甲乐内热造模小鼠的证候影响的观察。

1.2.3 大鼠和小鼠标准化诊法和辨证方法 依据有关文献[1、2]。

1.2.4 统计方法 采用SPSS11.0软件，对用药后/用药前检测值做方差分析。

1.2.5 综合以上实验结果，探索和构建中药药性实验检测方法。

2 结果

2.1 部分实验结果

(1)酵母混悬液皮下注射6 h后，大鼠(对照组)体温明显升高。大黄具有一定的纠正作用，提示该药性寒，而知母、淫羊藿未见明显的影响(图1);(2)优甲乐灌胃3 h后，小鼠(对照组)体温有一过性回升。大黄、知母性寒，有不同程度的纠正作用，而淫羊藿未见明显的影响。参考酵母混悬液皮下注射的阴性结果，提示知母寒性的药效可能具有不同的针对性或选择性(图2);(3)灌胃物理刺激对正常小鼠腋温有一定的影响。黄连解毒汤、大黄附子汤给药后，腋温有进一步下降的趋势，提示这2个复方的药性偏寒;而参附汤、吴茱萸汤有微弱的纠正趋势，提示药性偏热(图3);(4)对于优甲乐内热小鼠而言，栀子苷与栀子、淫羊藿苷与淫羊藿的药效趋势一致，提示两者确为这些生药的主要成分，且寒温药性一致(图4);(5)一些热性中药如吴茱萸、附子未见促进体温升高的作用，甚至反而下降，提示其热性主要来自于口感和消化道温热感觉，与体温无涉。

2.2 中药药性实验检测方法学

综合以上实验及有关研究进展，中药药性实验检测方法主要包括以下内容。

图1 酵母发热大鼠造模及药性检测

图2 优甲乐内热小鼠造模及药性检测

图3 正常小鼠及中药复方药性检测

图4 优甲乐内热小鼠及中药饮片和中药成分比较

2.2.1 实验动物 (1)原则:采用大鼠、小鼠等多品系动物综合实验，避免仅采用单一品系的实验动物;(2)小鼠。昆明种小鼠首选，其优点是价廉、温顺、个体差异均衡，缺点是不易出现发热反应、易于阳虚，其他品系小鼠如ICR、C57BL/6、Balb/c等可以采用或替代;(3)大鼠。Wistar大鼠首选，该品系大鼠酵母发热造模成模率高，是模拟外感热病发热与清热或泄热药理检测的理想模型;(4)其他实验动物。豚鼠、家兔等实验动物均有各自的优势，可以探索。

2.2.2 动物模型的选择 (1)原则:采用多模型实验动物的综合实验，避免仅采用单一模型的实验动物;(2)正常动物。模拟正常自愿受试者，观察用药后的寒热反应;(3)酵母发热大鼠模型。模拟外感热病患者。我国几千年来危害最大的是传染性热病，如伤寒和温病。药性寒热主要以此作为判断标准;(4)其他模型。如优甲乐内热模型、环磷酰胺虚寒模型，还可以尝试比较和筛选其他模型，以期获得最佳模型并模拟临床实际。我们的研究发现，一是优甲乐灌胃急性内热小鼠模型，造模3 h后体温有一过性升高，诱导热像不十分典型。该模型给药、检测时间间隔短、操作较为困难;二是环磷酰胺虚寒模型，是一个气血阴阳具虚的毒副作用模型，药物纠正比较难;三是回顾文献以及结合临床实际，可选择和发展适宜的模型，诸如自身免疫性疾病模型、代谢障碍模型等有广阔的发展空间。

2.2.3 动物实验设计原则 (1)大鼠、小鼠等实验动物综合运用，以及多种模型综合运用、综合比较及分析被检药物的药性，期望检测出某药药性具体体现在哪些方面，避免单一动物和模型所带来的偏差;(2)控制样本规模，重复实验。样本过大会造成实验操作困难、增加操作误差，因此可以缩减每批实验的样本数，并重复2、3次实验，进行结果综合分析。

2.2.4 分组设计 (1)正常对照组、模型组与各实验组;(2)灌胃纯水的正常和模型对照组。灌胃会对大鼠和小鼠证候产生一定的影响，因此应设灌胃纯水对照组，并以该组数据均数作为基数，所有数据与此基数比值并运算;(3)阳性药性药物对照药。作为寒热药性的标准，可选择一些药性覆盖面广、比较稳定的药物，如寒性药栀子、大黄等。

2.2.5 动物的标准化诊法与辨证 (1)设备和方法参见有关文献[1，2];(2)诊法检测指标:腋温、眼红外温度、尾红外温度及爪、尾、舌等显微数码拍照，提取反映红色程度的r值及体重、摄食量、饮水量和抓力、跨格数、站立数，;并计算出旷场、红色程度、体温等;(3)诊法检测时间点为用药前或用药后。一些长时程实验可以检测至自然恢复后。用药后检测点，应依据被试药物的药代动力学数据，预计寒热药性发挥作用的时间确定，通常应开展预实验;(4)实验人员应经过严格培训以及熟练和认真操作，以减少操作误差。

2.2.6 实验流程 (1)依据文献和预初实验，确定各初诊、造模、用药持续时间和时间点、用药后检测时间等，制定详细的实验方案;(2)购入实验动物常规进行饲养;(3)预检测，令实验动物习惯于诊法工作站及检测，以避免正式实验后可能带来的干扰(体检对于小鼠等实验动物是异常额外刺激，可能会造成恐惧和由此带来的检测数据失真);(4)造模前全套体检;(5)造模及用药;(6)用药起效后全套体检;(7)必要时增加恢复后全套体检;(8)数据分析。

2.2.7 数据分析与统计的一些要求 (1)数据的权重。一些检测数据的权重应依据其检测的灵敏度、稳定性以及实验动物的特点调整，四诊合参。如①体温=各动物腋温/对照组均数 ×0.5(～0.7)+各动物眼红外温/对照组均数×0.4(～0.2)+各动物尾根部红外温/对照组均数 ×0.1;②红色程度 =各动物爪r值/对照组均数×0.7+各动物尾 r值/对照组均数×0.3(C57等黑色小鼠尾r权重可降低)。(2)分析数据间的关系。一些数据间的关系值得关注，如眼红外测温(体内温度)与尾根部红外测温等其他体表温度检测。仔细分析可能有利于判断阳气内敛、阳气体内外分布;(3)数据统计与统计意义。鉴于大多中药对实验动物证候的影响不是十分显著，且易被灌胃和体检等额外刺激所干扰，因此得到具有统计意义的结果往往比较难，需要放大样本量，而后者会给实验带来困难，放大检测误差。因此，重复观察其数据趋势而不是苛求，其统计意义可能更具有可操作性，更为合理。

2.2.8 自愿受试者 (1)中药药性的判断，部分来自自愿受试者对药物的口感、皮肤感觉、消化道感觉，如温、热、辣、凉爽等，五味检测尤其如此。这些感受动物实验难以检测，因此应招募自愿受试者;(2)五味检测应采用盲法和气味刻度记录表，浓淡级别以文字细致刻画;采用0.5g生药/ml的药液(药物有效成分和有效部位依据其得率换算)，多人同步比较多味药物，互为对照，填表并量化评价，实验结束后统计分析;(3)传统中药饮片可以直接品尝，而新药则应在毒理评价安全的基础上进行。

3 讨论

3.1 中药药性评价具有广泛的需求

(1)目前临床常用中药的药性描述历代多有分歧。如人参其药性分别有平、微温、温、微凉、微寒等不同描述;又如蒲公英，其药性分别有平、微寒、寒等不同描述[5-7]。出现以上的分歧，究其原因可能与中药的产地、品种、炮制等因素有关，也可能与药性评价的方法差异有关。比如蒲公英在治疗外感热病中体现出寒性的药性，而作为常人的菜肴多未见寒性。因此，在产地、炮制等明确的情况下，进一步检测常用中药药性是必要的;(2)中药研发工作的需要。民间草药、地方草药是中药发展的源泉，而当代分离与提取的中药活性成分、有效成分组群、药效物质，以及中药复方新制剂是中药学发展的方向，这些中药的药性有待明确;(3)中医临床的广泛需求。当代的疾病谱发生了根本性的改变，以病原微生物感染导致的热性病、寒性病减少了，临床上以内伤杂病、难治病、不治病为主，病性、证候的内涵发生了改变。这就对药性的界定提出了新的要求:历代依据病原微生物感染寒、热病为主所建立的药性，在很大程度上需要再界定、再评价及丰富认识，以指导临床用药，满足中医临床日益增长的需求;(4)中医基础理论发展的需求。药性、证候、病机、藏象理论等之间存在着密切有机的联系，药性的问题不解决，验证和发展中医基础理论便会困难;(5)中药学科自身发展和完善的需求。药性作为中药的基本属性，中药学科的发展需要予以界定、规范并指导应用。

3.2 中药药性的由来

历史上，中药药性是从药物作用于机体所发生的反映概括出来的[5]。所谓“疗寒以热药”、“疗热以寒药”主要通过两个途径:正常人服用中药后产生寒热温凉的感受和证候表现，以及不同证候患者服用中药后产生的药效。值得注意的是，一些可以纠正因感染而出现寒热证候的药物，对正常人可能没有寒热作用;而对正常人产生寒热证候的中药，对外感热病也可能没有寒热的影响。因此，药性是通过多途径评价而日积月累逐渐形成的。

药性寒热温凉评价主要依据的4类证候:(1)寒象与热象。如用药后出现畏寒、形寒、喜热饮等药性为寒，发热、升火、怕热为热;以及局部寒热感受，如体温和体表温度等;(2)颜色。如面、唇、舌、指甲等青紫淡白为寒，红色为热;分泌物、排泄物、舌苔等黄色为热;(3)动静缓速。如脉迟缓为寒，脉数为热等;(4)干燥与湿润等津液多少。如分泌物、排泄物清长为寒，干燥为热。

3.3 中药药性的实验检测探索

上个世纪中叶，学术界开始了中医证候物质基础的研究，在采用寒或热的中药证候造模的基础上，涉及中药药性的实验检测[8]等。例如有人采用干姜灌胃大鼠造模，黄连等药物反证法研究中药药性[9]，也有人采用知母石膏汤、附子干姜汤灌胃大鼠观察其药性[10]。还有人观察干姜、黄芩等灌胃前、后大鼠红外热成像特征[11、12]等。而新近发展并趋于成熟的大鼠和小鼠标准化诊法与辨证方法[1、2]，给药性判断提供了标准化、计量化的方法学保障。鉴此，我们提出了建立和发展中药药性评价平台的假说[13]。通过本实验的系统研究，该假说得到了进一步的验证，并充分暴露了药性实验检测特点、效能和存在的问题等，给中药药性实验检测方法的完善和实用奠定了基础。

3.4 结论

(1)中药、中药复方和中药主要成分以及新的动、植物药，甚至是常用有效西药的药性，是可以被检测和准确刻画的;(2)“药物-生物效应”的药性检测，是在继承中医理论与实践的基础上，综合正常、证候、疾病等实验动物(大鼠、小鼠为主)，检测被检药物给药后所引发不同层次的生物效应。该技术采用大鼠和小鼠标准化、计量化的设备、方法与技术;(3)“药物-生物效应”密切关联的研究，是药性实验检测方法学的核心。通过该研究，可以充分、准确地刻画被检药物的药性;(4)受到实验动物特点的限制，部分药性的检测仍应采取自愿受试者评价的方式;(5)中药药性实验检测方法的发展趋势:①不断筛选和建立多样化的适宜证候模型，以涉及药性可能体现的大多途径;②不断筛选最为适宜评价药性的小鼠、大鼠等不同品系的实验动物;③扩大检测中药的范围，有助于充分暴露存在的技术问题并不断完善药性检测实验技术;④可以尝试被试药物制剂滴眼刺激兔眼结膜血管扩张实验、大鼠和小鼠胃黏膜病理观察、大鼠和小鼠饮食量和粪便质量观察等方法，探索和发展人类口感和消化道灼热感等检测替代方法。

[1]方肇勤主编.大鼠和小鼠辨证论治实验方法学[M].北京:科学出版社，2009.

[2]方肇勤主编.辨证论治实验方法学——实验小鼠诊法和辨证[M].上海:科学技术出版社，2006.

[3]H.G.沃格尔，W.H.沃格尔.药理学实验指南——新药发现和药理学评价(杜冠华等译)[M].北京:科学出版社，2001.

[4]陈奇.中药药理实验方法学[M].北京:人民卫生出版社，1993.1010.

[5]凌一揆主编.中药学[M].上海:科学技术出版社，1984.8.

[6]国家药典委员会.中华人民共和国药典，2000年版一部[M].北京:化学工业出版社，2000.

[7]江苏新医学院.中药大辞典[M].上海:科学技术出版社，1986.

[8]苟薇，管冬元，方肇勤.中药四性研究的现状与展望.四川中医，2010，28(4):36-39.

[9]李小梅，李续娥，孙桂波，等.归胃经寒性中药对胃热证大鼠胃机能的影响.中国中药杂志，2007，32(11):1065-1068.

[10]王米渠，严石林，李炜弘，等.寒热性中药对SD大鼠的实验研究.浙江中医学院学报.2002，26(6):43-45.

[11]李小梅，黄雪群，李续娥，等.采用红外热扫描成像系统研究归胃经寒性中药对胃热证大鼠的热效应.激光生物学报，2007，16(2):179-185.

[12]朱明，李宇航，林亭秀，等.关于中药寒热药性试验的红外成像观测.中国体视学与图像分析.2007，12(1):53－58.

[13]方肇勤，潘志强，卢文丽.建立和发展中药药性评价平台.中国中医基础医学杂志，2008，14(8):629-631.