疱疹清抗单纯疱疹病毒作用的实验研究

2011-06-11王笑红翟志光王克林

中国中医基础医学杂志 2011年1期

孙刚，王笑红，翟志光，王克林，孙萌

(中国中医科学院中医基础理论研究所，北京 100700)

单纯疱疹病毒可分为1型和2型，主要通过皮肤和黏膜密切接触传播，1型疱疹病毒主要感染腰以上部位的皮肤黏膜和器官，2型疱疹病毒主要引起生殖器发炎和疱疹。疱疹病毒引起的病情反复发作，迁延难愈，从而导致皮肤黏膜进一步感染，给病人造成很大的痛苦。阿昔洛韦是治疗单纯疱疹病毒的特效药，但能够引起急性肾功能损害等副作用。因此，寻找治疗作用好且副作用小的药物迫在眉睫。本文探讨中药制剂疱疹清对单纯疱疹病毒(HSV)作用机理，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 Hep-2细胞由中国预防医学科学院病毒学研究所提供。

1.1.2 病毒 HSV-1、HSV-2由中国预防医学科学院病毒学研究中心提供，本室传代冻存。

1.1.3 药物疱疹清由英佳兴业有限公司提供，批号为20040301，每克干粉相当于8.46 g生药;阳性对照药为市售阿昔洛韦(无环鸟苷)，批号031201，广东省珠海市丽珠集团丽珠制药厂生产。

1.1.4 试剂 DMEM(美国gibco公司)细胞培养液，96孔细胞培养板及其他实验材料均从吉泰科联生物有限公司购买。

1.1.5 动物昆明种小鼠，体重14g～16g，雌雄各半，由北京大学医学部提供，合格证号分别为SCXK(京)-001和 SCK(京)-006，中国中医科学院中医基础理论研究所动物室(清洁级)饲养。

1.2 步骤

1.2.1 体外实验疱疹清对Hep-2细胞半数中毒浓度(CC50)测定:向96孔培养板各孔加入100(I生长旺盛的 Hep-2细胞悬液，使每孔中含有104个细胞。置细胞培养板于37℃ 5%CO2培养箱中培养，待长成单层后向板内加入倍比稀释的疱疹清溶液，设细胞对照，72 h后用光学显微镜观察细胞病变(CPE)，用 Reed-Muench法算出药样对细胞的50%细胞中毒浓度(CC50)，以无毒浓度用于进行抗病毒实验。

疱疹清对 HSV-1、HSV-2感染 Hep-2细胞模型半数有效浓度(EC50)测定[1、2]:向 96 孔培养板各孔加入100(l生长旺盛的Hep-2细胞悬液，使每孔中含有104个细胞。置细胞培养板于37℃ 5%CO2培养箱中培养，待长成单层后将100个 TCID50的病毒液100(l加入除正常细胞对照外的各孔中，置细胞培养板于37℃ 5%CO2培养箱中，2h后弃去病毒液，再向细胞培养板中加入倍比稀释的对细胞无毒的疱疹清溶液。并设正常对照、病毒感染对照及阿昔洛韦阳性对照，置细胞培养板于37℃ 5%CO2培养箱中培养72h，在光学显微镜下观察细胞病变(CPE)。细胞无病变记作“－”，25%以下的细胞出现病变记作“+”，25% －50%的细胞出现病变记作“++，50% ～75%的细胞出现病变记作“+++”，75% ～100%的细胞出现病变记作“++++”，“+”和“－”视为CPE阴性，其余视为CPE阳性。

1.2.2 体内实验 HSV-1、HSV-2感染昆明小鼠LD50测定:选用正常健康14g～16g昆明小鼠，随机分为6组，设正常对照组，雌雄各半。各组小鼠接受 10倍比稀释的病毒悬液 0.02ml颅内注射[3－4]，观察记录14 d各组动物的存活数量，计算造成小鼠半数死亡的病毒浓度。

疱疹清对HSV-1、HSV-2型感染昆明小鼠死亡率影响:将小鼠随机分成疱疹清大剂量、中剂量、小剂量组、阿昔洛韦阳性对照组、模型组、生理盐水对照组。将单纯疱疹病毒1型和2型分别以100个LD50脑内注射0.02ml感染小鼠，空白对照组脑内注射0.02ml生理盐水。24h后开始灌胃给药治疗。小鼠的治疗剂量分别为人临床用量的22倍、11倍、5.5倍，折算成小鼠用量高、中、低分别为0.884 g/kg.d、0.442 g/kg.d和 0.221 g/kg.d。阳性对照药阿昔洛韦0.1g/kg.d给药;空白对照组及模型组分别灌胃生理盐水，每只0.2ml，连续给药7日。观察记录给药后14d内各组小鼠的生存时间和生存数量。

1.2.3 结果计算体外实验用Reed-Muench法计算药物对细胞半数毒性浓度(CC50)和药物抗病毒半数有效浓度(EC50)。

2 结果

2.1 体外实验

2.1.1 疱疹清对HEP-2细胞半数毒性浓度(CC50)的结果表1显示，疱疹清原浓度为100mg/ml。按1.2.1方法将疱疹清用DMEM维持液倍比稀释7个浓度，测定其对实验所用 Hep-2细胞的CC50。

表1 疱疹清对细胞半数毒性浓度(CC50)计算表

从上表可计算出疱疹清致半数细胞死亡的稀释倍数为224倍，由此得出半数毒性浓度(CC50)为0.446mg/ml。

2.1.2 疱疹清对HSV－1感染细胞的保护作用表2显示，将疱疹清用DMEM液配制成亚毒性浓度以下的若干个浓度进行抗HSV-1实验，方法如1.2.1所述。

表2 疱疹清对HSV-1感染细胞的保护作用

表2显示，疱疹清对HSV－1感染细胞50%保护率稀释倍数为1280，得出疱疹清对HSV-1感染细胞保护作用的 EC50为0.078mg/ml，TI为5.7。

2.1.3 疱疹清对HSV-2感染细胞的保护作用将疱疹清用DMEM液配制成亚毒性浓度以下的若干个浓度进行抗HSV-2实验，方法如1.2.1所述。

表3 疱疹清对HSV-2感染细胞的保护作用

表3显示，疱疹清浓度在0.04217mg/ml时，对HSV-2的抑制率即对感染细胞的保护率为50%，TI为10.6。

2.2 体内实验结果

2.2.1 疱疹清对HSV-1致小鼠脑炎(HSE)治疗作用观察表4显示，模型组小鼠全部死亡，而中剂量存活率高达50%，其他2组存活率也有不同程度的提高;生存时间上中剂量组平均为9.81 d，与模型对照组比较 P<0.01;大剂量生存天数平均为8.63 d，和模型对照组比较 P<0.05，表明此药对单纯疱疹病毒1型引起的小鼠脑炎有较好的疗效。

表4 疱疹清对HSV-1致小鼠脑炎治疗作用结果

2.2.2 疱疹清对HSV-2引起小鼠脑炎治疗作用观察表5显示，给药各组中中剂量组存活率为22%，大剂量组存活率为11%，而模型组全部死亡;中剂量组和大剂量组生存天数平均分别为9.28d和8.39d，小鼠生存天数和模型组比明显延长，中剂量组和模型组比较P<0.01，大剂量组和模型组比较P<0.05，表明此药对单纯疱疹2型病毒引起的脑炎有一定的疗效。