沈晓君，魏 群，陈 芳，魏 晏

(1.河南中医学院，河南 郑州 450008;2.华中科技大学同济医学院，湖北 武汉;3.河南中医学院第三附属医院，河南 郑州450008)

血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)增殖在动脉粥样硬化(athemsclerosis，AS)、经皮冠状动脉腔内球囊成型术后再狭窄和高血压等多种心血管疾病的病理变化中起着重要作用[1]，因此促进过度增生的VSMC凋亡对防治AS有积极的意义。中药黄酮类化合物葛根素(puerarin，C21H20O9)为豆科葛属植物野葛干燥根中提取的异黄酮类主要有效成分之一，其化学名为4，7-二羟基-8-D-葡萄糖基异黄酮。研究表明，葛根素对冠心病、脑梗死等有很高的应用价值，是近年来研究证实对心血管疾病有明显作用的中药单体。本课题通过观察葛根素对氧化低密度脂蛋白(oxLDL)诱导增殖的兔VSMC细胞周期变化及细胞周期调控相关蛋白E(cyclin E)和细胞周期素依赖性激酶抑制蛋白p27表达的影响，探讨其可能存在的促进VSMC凋亡从而延缓或逆转AS病变的作用，为葛根素抗AS药理作用的研究提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞株

兔主动脉平滑肌细胞由中国协和医科大学基础医学院细胞培养中心提供。

1.2 药品及试剂

葛根素标准品均购自中国药品生物制品鉴定所，纯度99%，20mg/瓶，批号200511;oxLDL由我室制备[2];胰蛋白酶、DMEM 为 Gibco BRL.USA 产品;胎牛血清购自杭州四季青公司;鼠抗人 p27单抗(1∶100)、兔抗人 cyclin E 单抗(1∶100)、羊抗鼠FITC-IgG(1∶400)、羊抗兔 FITC-IgG(1∶400)试剂均购自Santacruz.USA。

1.3 主要仪器

德国GMBH公司Hera C02细胞培养箱，苏净集团安泰公司209b型超净工作台，日本 Olympsu Optical公司 BH-NIC-B型倒置显微镜，BD.USA公司FACS Calibur流式细胞仪。

1.4 细胞培养与实验分组

兔主动脉平滑肌细胞置于含有10%小牛血清的PRMI-1640培养基中，加入终浓度为 100mg·L－1的链霉素与青霉素，在37℃ 5%CO2条件下培养，用含0.01%EDTA的0.25%胰酶进行消化传代，处于对数生长期的第3到第5代细胞用于实验。细胞按1×108·L－1密度稀释后接种于 96孔培养板培养24h，将细胞分为空白组、LDL模型组、葛根素药物处理组，每组设6个复孔。除空白组外，各组均加入oxLDL，剂量为 50mg·L－1，培养 24h 后葛根素组分别加入终浓度 10－5mol·L－1、10－6mol·L－1，、10－7mol·L－1的葛根素，培养48h后分别收集细胞。

1.5 细胞周期分析

收集细胞 1000r·min－1离心 5min，弃去培养液;PBS洗涤2次;离心去PBS，加入冰预冷的70%的乙醇固定，4℃避光固定过夜。800r·min－1离心 10min去上清，PBS清洗 2次;重悬细胞于 500μl含100unit/ml RNaseA的 PBS缓冲液中，避光37℃孵育30min;加 2mg/ml PI至终浓度 50μg/ml，避光孵育30min，以PI荧光读数为横坐标，细胞数为纵坐标，在流式细胞仪上分析细胞周期。

1.6 细胞周期调控相关蛋白cyclin E和p27表达的检测

取生长状态良好的细胞胰酶消化后制备细胞悬液加入试管中，调整细胞浓度为1×106/mL个，加入鼠抗人p27、兔抗人 cyclin E单抗100μL，室温孵育30 min，PBS 洗涤 1 次，300 ～500r·min－1离心5min去上清，加入羊抗鼠 FITC-IgG、羊抗兔 FITCIgG二抗 100μL，避光室温孵育 30min，PBS洗涤 1次，300 ～500r·min－1离心 5min 弃上清，加入1mLPBS液，500目铜网过滤后上机检测，每份标本测定5000个细胞，同时设PBS代替一抗和二抗、仅加一抗、仅加二抗的阴性对照。

1.7 数据统计与分析

2 结果

2.1 葛根素对VSMC增殖周期的影响

表1显示，与 LDL组比较，葛根素组 G0/G1期细胞数增多，S期细胞数明显减少 (P<0.01)，提示葛根素具有抑制VSMC增殖的作用。

表1 葛根素对VSMC增殖周期的影响(s)

表1 葛根素对VSMC增殖周期的影响(s)

注:与空白组比较:△P<0.01;与LDL组比较:*P<0.01

组 别 剂量 G0/G1 S G2/M空白组 —25.81±1.65 68.14±2.58 10.28±2.23 31.32±1.58模型组 50mg·L－1 39.92±3.09△ 26.83±1.89△ 37.13±2.01葛根素 10－7mol·L－1 57.47±2.62* 16.91±2.07* 19.56±2.76 10－6mol·L －1 57.39 ±2.51* 16.67 ±0.31* 22.32 ±2.14 10 －5mol·L －1 59.11 ±2.17* 14.04 ±1.89*

2.2 葛根素对VSMC cyclin E和p27蛋白表达的影响

表2显示，流式细胞仪检测结果显示，葛根素处理组细胞cyclin E表达量随淫羊藿苷与葛根素剂量增加而减少;p27蛋白表达量则明显增加，与LDL组比较差异显著(P<0.05、P<0.01)。

表2 葛根素对VSMC cyclin E和p27蛋白表达的影响(s，n=6)

表2 葛根素对VSMC cyclin E和p27蛋白表达的影响(s，n=6)

注:与 LDL 组比较:*P<0.05，**P<0.01

组 别 剂量cyclin E p27空白组 —9.85±1.17 19.63±1.25模型组 50mg·L－1 18.46±2.96 7.22±2.27葛根素 10 －7mol·L －1 14.13 ±1.66* 14.46 ±0.98**10 －6mol·L －1 13.57 ±1.71* 15.09 ±1.32**10 －5mol·L －1 11.27 ±1.09** 17.98 ±1.36**

3 讨论

平滑肌细胞是血管壁中产生细胞外基质的主要细胞，在oxLDL等致AS刺激因子的作用下可分泌大量细胞外基质，迁移至内膜下增生并吞噬脂质，形成肌源性泡沫细胞。oxLDL不能被正常LDL受体识别，但可被巨噬细胞的清道夫受体识别并快速摄取，促进其形成巨噬细胞源性泡沫细胞。被激活的巨噬细胞还可释放多种细胞因子，促进VSMC增生，形成AS病变。因此，血管壁内过多生成的活性氧使内皮下间隙的LDL氧化修饰生成oxLDL是AS病理过程中最重要的早期事件，在AS斑块形成过程中具有重要的引发作用[3]。oxLDL不仅具有 VSMC的促增殖效应，而且对血管内皮细胞有损伤作用，两者共同构成AS时血管损害的病理学基础。

近年来的研究证实，葛根的异黄酮类成分有降血脂、降血压、扩张冠状动脉、降低心肌氧耗量、抗心律失常等作用，其对心脑血管疾病预防与治疗的潜力逐步被发现并开发。我们前期的研究[4]证实，葛根素可抑制同型半胱氨酸诱导的VSMC过度增殖，促进其凋亡。本实验中LDL模型组与空白组比较，G0/G1期细胞数减少，S期细胞数增多，进一步证实oxLDL具有VSMC的促增殖效应;葛根素组G0/G1期细胞数明显增多，S期细胞数明显减少，提示细胞周期阻滞是葛根素抑制VSMC过度增殖的机制之一。

细胞周期在细胞周期素(Cyclin)、细胞周期素依赖激酶(cyclin dependent kinase，CDK)、细胞周期素依赖激酶抑制因子(cyclin dependent kinase inhibitor，CDKI)组成的立体调控网络精密控制下进行[5]。调节作用主要是通过 Cyclin随细胞周期不同时相进行合成和降解，通过CDK有序的磷酸化和去磷酸化来实现[6]。G1/S是细胞周期启动最重要的调控点，它是细胞惟一能从外界接受增殖信号或抑制信号的时期。G1/S调控点也是细胞周期重要的检测点，此点决定细胞进入分裂程序、发生凋亡或进入静止的 G0期。一旦细胞通过此限制点，就可以不依赖外源性的增殖、分裂信号刺激而自主地完成增殖周期。CyclinE作为调节亚基，与催化亚基CDK2形成活性复合物 CyclinE/CDK2，G1/S调控点是CyclinE/CDK2在细胞周期中的作用点，CyclinE/CDK2启动DNA复制，驱动细胞由G1期前行至S期，决定了细胞的增殖趋势。

P27蛋白是CDKI家族成员之一，具有参与细胞周期调控、诱导凋亡、促进细胞分化等多种生物学功能。P27为停止细胞分裂所必需，在休止细胞内高表达，而在增殖细胞内则呈低表达。P27蛋白通过抑制CDK或其复合物的活性来调控细胞周期进程，作为细胞周期负调控因子，P27与G1后期所形成的CyclinE/CDK2复合物结合，通过C-末端抑制CDK2磷酸化，灭活其激酶活性，阻止细胞由G1期进入S期，抑制细胞分裂、增殖，促进细胞凋亡。研究表明，抗有丝分裂原所诱导的细胞生长抑制均伴有P27蛋白水平升高[7、8]，上调 P27和下调 CyclinE 可发挥抑制 VSMC 增殖的作用[9、10]。本研究中，流式细胞仪检测结果显示，葛根素处理组细胞cyclin E表达量随葛根素剂量增加而减少;p27蛋白表达量则明显增加，提示葛根素使体外培养的兔VSMC细胞周期阻滞于G0/G1期的主要机制是负调控 G1→S期检测点，使细胞不能由 G1期进入 S期，从而抑制VSMC细胞周期。本实验结果表明，葛根素可通过细胞周期阻滞使VSMC增殖减弱，cyclin E和p27是其作用靶点之一。

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