邓 炜，郑民强，张 静，黄 聪

(贵阳中医学院药理学教研室，贵州贵阳 550002)

淫羊藿总黄酮(TFE)是淫羊藿主要药效成分，而淫羊藿苷(ICA)则是淫羊藿总黄酮中的主要药效物质基础。黔产粗毛淫羊藿(Epimedium acuminatum)、黔岭淫羊藿(E.leptorrhizum)为《贵州省中药材、民族药材质量标准》收载，是淫羊藿常用中药及民族药。据研究贵州产多种淫羊藿的TFE、ICA含量均能达到或超过《中国药典》标准，但黔岭淫羊藿ICA含量却很低，小于0.1%［1］，其药理作用研究未见报道。据报道 TFE、ICA有益智，增强记忆作用［2－3］。本研究分别提取两种 TFE，对 D 半乳糖(D-gal)-三氯化铝(AlCl3)复合致记忆损伤模型大鼠进行实验研究，以评价其药用价值。

1 仪器与材料

1.1仪器Morris水迷宫系统(中国医学科学院药物所);OLYMPUS BH-2光学显微镜(日本)。721B分光光度计(上海精密仪器仪表公司);

1.2试药淫羊藿药材分别采自贵州贵阳市乌当区，贵州惠水县，经贵阳中医学院何顺志教授鉴定为粗毛淫羊藿Epimedium acuminatumFranch、黔岭淫羊藿E.leptorrhizumStearn。D-gal(张家港华昌药业有限公司，批号:20100228);AlCl3(天津市致远化学试剂有限公司，批号:20080418);银杏叶片(桂林兴达制药厂，批号:091101);T-chE测试试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号:201000114);免疫组化试剂盒 Bcl-2，克隆号:08C02;Bax，克隆号:09A01(武汉博士德生物工程有限公司);二抗，批号:PV6001;DAB显色系统，批号:9032(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.3动物SD♀大鼠，10月龄，体质量(400±20)g，由贵阳医学院实验动物中心提供〔动物许可证号:SCXK(黔)2002-001〕。

2 方法

2.1实验用药制备两种淫羊藿TFE提取，各取干燥淫羊藿茎叶1 kg，照文献［4］方法提取，总黄酮提取物得率分别为3.43%和2.74%;经UV法测定其TFE含量(以ICA计)分别为38.4%和11.4%;分别用生理盐水稀释后供实验用药。

2.2模型复制采用D-gal和AlCl3联合诱发大鼠学习记忆障碍模型，除空白组给予生理盐水，各组采用 ipD-gal 150 mg·(kg·d)－1和 ig AlCl310 mg·(kg·d)－1，连续 84 d。

2.3分组及给药经筛选合格的大鼠随机分7组，每组10只，为空白组(A)、模型组(B)、银杏叶片对照组 50 mg·kg－1(C)、粗毛淫羊藿 TEF 高、低(100、50 mg·kg－1)剂量组(D，E)、黔岭淫羊藿 TEF高、低(100、50 mg·kg－1)剂量组(F，G)。各治疗组于造模同时即按分组剂量ig给予TFE，每天1次，连续84 d。常规观察动物行为状态，每周记录1次体质量。d 79开始进行水迷宫试验;d 85处死大鼠，进行有关指标检测。

2.4行为学实验用Morris水迷宫实验判断大鼠学习记忆和认知能力，以定位航行、空间探索为指标。记录大鼠在120 s内寻找到并爬上对侧象限正中平台所用时间，为逃避潜伏期;再撤除平台，记录大鼠在120s内穿越平台所在区域的次数，测试其空间探索记忆能力。逃避潜伏期测定，每天2次，测5 d;空间探索能力测试，每天2次，测1天，共6 d。

Tab 1 Effects of the two TFE on memory process in D-gal-AlCl3modeled rats(±s，n=8)

Tab 1 Effects of the two TFE on memory process in D-gal-AlCl3modeled rats(±s，n=8)

A:Control;B:Model:C:Yinxingyepian;D，E:the high，low dose Epimedium acuminatum TFE groups respectively;F，G:the high，low dose E.leptorrhizum TFE groups respectively.＊＊P ＜0.01 vs control(A)group;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs D-gal-AlCl3(B)group;▲▲P＜0.01 D vs F;◆◆P ＜0.01 E vs G

Group Dose/mg·kg－1 Escape latency/s d 2 d 3 d 4 d 5 Number of cross platform/Times A－63.74 ±13.69 48.63 ±8.65 43.46 ±10.78 30.41±7.88 5.69 ±1.16 B － 101.63 ±20.50＊＊ 78.35 ±11.79＊＊ 75.00 ±16.14＊＊ 58.28 ±19.01＊＊ 2.75 ±0.96＊＊C 50 73.12 ±26.12# 52.49 ±18.0## 48.28 ±12.83## 40.15 ±13.84# 4.43 ±1.57##D 100 79.90 ±15.44# 51.68 ±13.28## 38.82 ±19.36##▲▲ 37.57 ±11.87#▲▲ 4.94 ±1.29##E 50 69.25 ±37.26# 56.03 ±15.89## 43.63 ±13.70##◆◆ 38.89 ±15.16#◆◆ 4.31 ±1.56#F 100 86.13 ±29.66 60.51 ±17.35# 54.19 ±15.93# 52.12 ±19.04 3.69 ±1.44 G 50 87.01 ±30.75 68.64 ±12.77 67.58 ±14.42 60.69 ±17.20 3.50 ±1.81

2.5大鼠脑、血组织AChE测定实验结束断颈取血，离心取血清，比色法测定血AChE活性;在冰盘中迅速取大鼠脑皮层组织，冰浴下切碎加预冷生理盐水制成10%匀浆，3 000 r·min－1离心10 min，取上清液比色法检测脑AChE活性。实验步骤严格按试剂盒说明书进行。

2.6大鼠脑海马免疫组化染色及结果判定大鼠处死，迅速取脑组织4%多聚甲醛固定。以Bcl-2/Bax为测定指标。常规脱水、透明、封片，按要求进行DAB显色。随机选取5个视野400倍镜下观察海马神经细胞，Bcl-2和Bax阳性为棕黄色颗粒，主要定位在细胞质中。计数500个神经细胞中阳性细胞数，取均值进行统计分析。

2.7统计学处理各组数据结果以±s表示，数据用 SPSS16.0分析处理，组间比较采用t检验;多组比较采用单因素方差分析。

3 结果

3.1两种淫羊藿TFE对大鼠行为学影响Tab1结果见模型组逃避潜伏期明显增加，跨越平台次数明显减少，与空白组比较P＜0.01。提示D-gal-AlCl3复合造模已形成大鼠空间记忆障碍。从测试d 2起，C、D、E组逃避潜伏期即有明显降低，d 3以后其差别愈明显，大鼠逃避潜伏期缩短，跨越平台次数增加，粗毛淫羊藿各组与银杏叶片组比较无明显差别;与黔岭淫羊藿比较，d 4以后逃避潜伏期出现明显差异(P＜0.01)。

3.2两种淫羊藿TFE对大鼠脑组织与血清的AChE活性的影响Tab 2显示D-gal-AlCl3模型组大鼠血浆及脑组织中AChE升高非常明显(P＜0.01)。TFE各组无论血浆及脑组织中AChE都有所降低，粗毛淫羊藿各组与银杏叶片组降低AChE强度相似，比模型组差异有显著性(P＜0.01);与黔岭淫羊藿比较，粗毛淫羊藿无论高、低剂量组对SAChE的降低差异有显著性(P＜0.01)。

Tab 2 Effects of the two TFE on brain and serum AChE activity in D-gal-AlCl3modeled rats(±s，n=8)

Tab 2 Effects of the two TFE on brain and serum AChE activity in D-gal-AlCl3modeled rats(±s，n=8)

A:Control;B:Model:C:Yinxingyepian;D，E:the high，low dose Epimedium acuminatum TFE groups respectively;F，G:the high，low dose E.leptorrhizum TFE groups respectively.＊＊P ＜0.01 vs control;#P ＜0.05，##P＜0.01 vs D-gal-AlCl3;▲▲P＜0.01 D vs F;◆◆P＜0.01 E vs G

Group Dose/mg·kg－1 Brain AChE activity/U·mg－1Pro Serum AChE activity/U·mg－1Pro A －1.12 ±0.13 32.02 ±1.51 B－1.48 ±0.14＊＊ 38.33 ±1.80＊＊C 50 1.31 ±0.10## 32.43 ±1.80##D 100 1.32 ±0.07## 32.89 ±1.33##▲▲E 50 1.34 ±0.09## 31.51 ±1.32##◆◆F 100 1.39 ±0.08# 36.99 ±1.53 G 50 1.45 ±0.11 36.30 ±1.47

3.3两种淫羊藿TFE对大鼠海马BAX与Bal-2蛋白表达的影响

3.3.1两种淫羊藿TFE对大鼠海马BAX蛋白表达

结果见Tab 3和Fig 1。结果显示BAX蛋白在模型组(B)中表达(Fig 1中棕色颗粒)明显高于其他各组(P＜0.01);各给药组中银杏叶片组(C)表达最低，粗毛淫羊藿TEF高(D)组其次，以后各组依次渐增高，两两比较(CvsD;DvsE;DvsF;FvsG)差异均有显著性(P＜0.01)。

3.3.2两种淫羊藿TFE对大鼠海马组织Bal-2蛋白表达的影响Tab 3和Fig 2结果可见Bcl-2蛋白在C组和D组中高表达，明显高于其他各组(P＜0.01);其他各组依次为C组＞D组＞E组＞F组＞G组，且两两比较差异均有显著性(P＜0.01);但A组与G组比较差异无显著性(P=0.321)。

Fig 1 Effects of two TFE on the protein expression of BAX in the hippocampus in modeled rats

Fig 2 Effects of two TFE on the protein expression of Bal-2 in the hippocampus in modeled rats

Tab 3 Differences between the two TFE on the hippocampus BAX and the protein expression of Bal-2(±s，n=5)

Tab 3 Differences between the two TFE on the hippocampus BAX and the protein expression of Bal-2(±s，n=5)

A:Control;B:Model:C:Yinxingyepian;D，E:the high，low dose Epimedium acuminatum TFE groups respectively;F，G:the high，low dose E.leptorrhizum TFE groups respectively.＊＊P ＜0.01 vs control(A);△△P＜0.01 vs B;##P＜0.01 vs C;☆☆P＜0.01 vs D;▲▲P＜0.01 vs E;$$P＜0.01 vs F

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4 讨论

痴呆和脑老化动物模型有多种方法可选，D-gal模型、三氯化铝模型均是得到公认并常用的方法，单因素造模只能模拟衰老诸多病理变化中一个侧面，D-gal可使神经元氧化损伤，变性坏死，出现衰老，学习记忆功能损害，在一定程度上模拟了AD认知功能障碍的发病特点［5］。铝可通过多种途径在中枢沉积，甚至可通过乳汁、胎盘传给子代［6］，铝过负荷即可导致神经元退变、海马内Aβ形成，神经元缠结等AD特征性病理改变［7］，可造成学习记忆障碍。两者联用造模，势必加速其衰老病理改变和进程。本实验则选用10月龄大鼠并联用D-gal-AlCl3，经过3个月获得大鼠空间记忆障碍模型。

黔产粗毛淫羊藿TFE各组大鼠在Morris水迷宫实验中表现记忆认知能力明显增强，AChE活性明显下调，致使ACh含量增加，这可能是淫羊藿增强动物学习记忆的药效学基础。神经细胞凋亡是脑细胞丢失的一种形式，其机制与促凋亡基因和抗凋亡基因表达有关，Bcl-2/Bax是目前研究较明确的一对在功能上相互对立的凋亡调控基因，Bcl-2基因过度表达可特异性抑制细胞凋亡;而Bax基因表达则可对抗Bcl-2对细胞凋亡的抑制作用。Bcl-2/Bax的比率改变与神经元凋亡密切相关［8］。本实验显示D-gal-AlCl3大鼠模型组Bcl-2表达降低，Bax表达增强，Bcl-2/Bax表达比值呈负相关性，呈促进细胞凋亡之势，从B组图片亦可见海马神经细胞的退行性改变及凋亡现象非常明显。而2种淫羊藿TFE可上调D-gal-AlCl3诱导的Bcl-2表达，下调Bax表达，使Bc1-2/Bax比值逆转，抑制细胞凋亡，揭示黔产淫羊藿TFE对海马神经元的保护作用。尤其是粗毛淫羊藿TFE改善D-gal-AlCl3大鼠记忆障碍，增加ACh，抗凋亡作用非常明显，具有易化记忆、提高智力和减缓智力衰退作用，这可能与粗毛淫羊藿TFE中ICA含量较高有关。

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