颜丕熙，李国新，吴晓刚，闫丽萍，滕巧泱，李泽君

（中国农业科学院上海兽医研究所 农业部动物寄生虫学重点开放实验室，上海 200241）

2010年春季以来，上海市、江苏省、浙江省、安徽省等地相继爆发一种导致蛋鸭减产、生长迟缓和死亡的一种新发病，研究证明引起该病的病原为坦布苏病毒（Tembusu virus）[1,2]。该病毒可经空气传播，对蛋鸭及肉鸭均有致病力。病鸭主要表现为高热、运动障碍、食欲下降甚至废绝、产蛋下降甚至停止，严重可导致死亡，死亡率可达5%～10%。剖检可见脾脏明显肿大；肝脏出血严重，伴有针尖状白色坏死点；卵巢发生出血、萎缩、破裂，输卵管有粘液[1,2]。由于该病毒为新发病原，目前尚无可靠的检测方法。本研究组曾使用RT-PCR方法对临床样品进行检测，但发现RT-PCR的敏感性比较差，不能有效的检测出该病毒。近年来套式RTPCR在疾病的诊断方面显示出灵敏、特异的优点，在登革热病毒[3]、蜱传脑炎病毒[4]和西尼罗病毒[5]等黄病毒的检测中都得到了很好应用。鉴于此，本研究建立了套式RT-PCR方法，该方法能够快速、敏感、特异地检测出鸭坦布苏病毒，为该病快速诊断与流行病学调查奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 鸭坦布苏病毒的增殖 鸭坦布苏病毒（FX2010）由本研究室分离鉴定。取保存的病毒液100 μL接种9日龄SPF鸡胚，收集24～120 h死亡鸡胚胚体，胚体研磨后，7500×g离心30 min，吸取上清，滴定病毒含量后，用于后续试验。

1.2 引物设计 根据坦布苏病毒（FX2010）E基因序列设计两对特异性的重叠引物（表1），引物由上海Invitrogen公司合成，用DEPC水稀释至终浓度为10 μmol/L，分装后冻存于-20℃。……