赵丽丽，刘忠，张渝洁

Hath1 也称作 ATOH1（atonal homolog 1），是一个碱性螺旋-环-螺旋结构（basic helix-loop-helix,bHLH）的转录因子。Hath1 基因与果蝇属 atonal基因和鼠 Math1（mouse atonal homolog 1）基染色体同源，定位于人染色体 4q22，mRNA 长 1065 bp，编码蛋白 38 kD[1]。结肠癌是常见的恶性肿瘤，发病率逐年上升，Hath1 基因能促进肠分泌细胞包括杯状细胞（goblet）的终末分化，并诱导黏蛋白 2（mucin 2）的表达[2]。在结肠癌发生的渐进累积过程中，杯状细胞逐渐减少甚至消失，黏蛋白也明显减少[3]。在绝大多数结肠癌中 Wnt 信号一直处于活化状态[4]，使得 Hath1 的表达受到抑制。而Hath1 基因的表达可以促进结肠分泌细胞的分化，Hath1 基因表达的缺失限制了分泌型细胞的分化。因此尝试在结肠癌中表达 Hath1 基因，研究 Hath1在结肠癌中是否可以发挥肿瘤抑制基因的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 肿瘤细胞 HT-29、LS174T、SW480、SW620、IEC-6 购自上海生命科学院；Lipofectamine Reagent 转染试剂盒购自美国 Invitrogen 公司；RT-PCR 试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司；MTS 购自美国 Promega 公司；trizol 购自上海生物工程公司；DNase I 购自大连宝生物公司；荧光染料超混合液购自美国 BioRad 公司；细胞 RNA抽提试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司；pcDNA3.1(+) 大肠杆菌菌保（DH5 a）菌株由本公司保存。

1.1.2 仪器 FCAS440 流式细胞仪为美国 BD公司产品；Model 680 酶标仪为美国 BioRad 公司产品；7700 型实时荧光定量 PCR 仪为美国Applied Biosystems 公司产品。

1.2 方法

1.2.1 总 RNA 的提取 肿瘤细胞在 10cm 培养板中培养到 80%密度的时候，用 trizol 试剂提取细胞总 RNA。吸去细胞培养液，加入 3 ml trizol试剂，轻轻摇匀，室温放置 5min 使细胞裂解完全，收集裂解液于离心管中，加 300 µl 氯仿剧烈摇匀，室温放置 2min，4℃12 000×g离心 15min，取上层水相到另一离心管内，加入 750 μl 异丙醇摇匀，室温放置 10min，4℃12 000×g离心 10min，弃去上清，用 1 ml 焦碳酸二乙酯（DEPC）–75%乙醇洗涤沉淀，晾干，溶解于 100 µl DEPC 水中。……