王钦富，李坤，李志，徐娜，董敏，韩慧

转化生长因子 β 激活激酶（transforming growth factor-β-activating kinase 1，Tak1）为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在功能与序列上与丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶（mitogen—activated protein kinase kinase kinase，MAPKKK）相关，属于 MAPKKKs 家族成员。众多研究表明 Tak1 介导的信号转导通路参与了炎症（如脓毒症）、免疫反应、细胞凋亡和纤维化疾病等病理生理过程以及细胞周期调控与细胞分化等过程，因而 Tak1 参与调控的信号通路与人类疾病的关系日益受到普遍关注。Tak1 基因在 T、B 免疫细胞中起到非常重要的作用，但在髓样细胞中的作用尚未见报道。本文利用 siRNA 技术使小鼠腹腔巨噬细胞 Tak1 基因沉默并观察其生物学效应，初步探讨 Tak1 基因在髓样细胞中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

昆明纯种小鼠（No：SCXK2002-0002），II 级，体重 18～22 g，购自大连医科大学动物中心。靶向Tak1 基因的 siRNA（正义链 5’ GCUCAUGCCAU GAGCUGGUGUUUAC 3’，反义链 5’ GUAAACAC CAGCUCAUGGCAUGAGC 3’，MSS218539）、Trizol总 RNA 抽提试剂、逆转录试剂盒 Super Strip III为美国Invitrogen 公司产品；IL-1β ELISA检测试剂盒为美国 R&D 公司产品；NucleofectorTM试剂为德国 Amaxa 公司产品。巨噬细胞培养液：DMEM 培养液，加 10%胎牛血清（FBS）、谷氨酰胺（使终浓度为2mmol/L）。无水乙醇、氯仿、异丙醇均为国产分析纯；焦碳酸二乙酯（DEPC）为美国 Sigma 公司产品。Prism 7700 PCR仪为美国 ABI 公司产品。

1.2 方法

1.2.1 小鼠腹腔巨噬细胞培养 取昆明纯种小鼠，腹腔注射 4%巯基乙醇酸钠（thioglycolate）1～2 ml，3～5 d 后行麻醉、脱颈致死，用巨噬细胞培养液灌洗腹腔，吸出培养液，放入无菌平皿铺板 3～5 h，吸弃上清，用培养液洗涤 1 次，备用。

1.2.2 siRNA 基因沉默的最佳转染浓度和时间的优化 备用小鼠腹腔巨噬细胞 100 g，洗涤 5min，取 1.5×106个巨噬细胞加 100 μl Nucleofactor 溶液，分别加入 0.6、1.2、1.6 μmol/L Tak1 siRNA，混匀，并设立空白对照。移入电转杯（勿产生气泡），放置电转仪，实施转染。……