郝 帅，闫艾慧，姜学钧

(中国医科大学 第一临床医院 耳鼻咽喉科，辽宁 沈阳 110001)

顺铂以其广谱高效性在抗肿瘤治疗中被普遍应用，但其肾毒性和耳毒性的副作用使得目前临床应用被严格控制[1]，特别是顺铂可造成听功能永久性损伤[2]。本研究组前期实验发现孕晚期顺铂暴露致子代豚鼠毛细胞损伤及听力下降，但孕期顺铂暴露致子代出生后毛细胞损伤的研究未见报道。因此，本实验通过检测顺铂能否诱导毛细胞凋亡，为顺铂耳毒性研究及其防护提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 主要试剂与仪器

顺铂注射剂为齐鲁制药产品，兔抗Caspase-3多克隆抗体为美国Cell Signalling Techenology公司产品，TUNEL试剂盒为美国BD Biosciences公司产品；冰冻切片机位德国SLEE公司产品，光学显微镜为日本Olympus光学工业产品。

1.2 实验动物

健康白色红目受孕豚鼠12只(体重600～700 g)，中国医科大学动物部提供。双侧耳廓反射灵敏，在安静的环境下饲养。实验动物生产许可证号：SCXK(辽)2003-0009；使用许可证号：SYXK(辽)2003-0013。

1.3 动物分组与处理

随机分成两组，每组6只，从孕50 d至56 d连续腹膜内注射：(1)对照组：生理盐水1.5 mg/kg·d；(2)顺铂组：顺铂1.5 mg/kg·d。子代出生后14 d，分离仔鼠右侧耳蜗，行TUNEL染色和Caspase-3免疫组化染色。

1.4 耳蜗冰冻切片制备

快速打开胸腔，左心室穿刺，接灌流液，右心耳剪开。先以4℃生理盐水经心脏灌流，待右心耳处流出液体为无色时，改以4℃新鲜配置的4%多聚甲醛磷酸缓冲液(0.1 mol/L，pH=7.4)约300 mL灌流固定。快速断头，取双侧听泡4%多聚甲醛溶液固定24 h，10%甲酸-甲酸钠常温脱钙1周。30%蔗糖4℃过夜，聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物冰冻切片包埋剂包埋，恒冷箱切片机沿蜗轴平行方向行10 μm厚连续切片。……