代 利 李绣花 赵新平 董小霞 倪淑华

(山西医科大学公共学院营养与食品卫生教研室，山西 太原 030001)

目前，临床一线的调脂药物以他汀类及贝特类为主，但因需长期应用，或者联合用药，其肝脏损害的副作用常常成为限制其临床应用的重要原因〔1〕。芝麻作为常用的油料作物，其营养价值已经得到公认〔2，3〕。其主要活性成分芝麻素具有降低胆固醇、抗氧化、降血压等作用〔4〕。汪五三等〔5〕研究发现，芝麻素对扑热息痛、酒精、四氯化碳所致的肝损伤有一定的保护作用，对非酒精性脂肪肝病(NAFLD)的作用如何研究报道较少。本研究探讨芝麻素对大鼠NAFLD的防治作用及其可能机制。

1 材料与方法

1.1 饲料配制、动物分组及喂养 基础饲料由山西医科大学医学院动物实验中心提供，高脂饲料按1%胆固醇、5%猪油、0.25%胆酸盐、93.75%基础饲料的比例配。由山西医科大学实验动物中心提供清洁级SD雄性大鼠，体重90～110 g，经基础饲料适应性喂养3 d后，测体重及血清总胆固醇(TC)，按体重及血清TC水平将动物随机分为普通对照组、高脂模型组、芝麻素低、中、高剂量组，每组8只动物。大鼠单笼喂养，自由摄食及饮水，每周测量1次体重及摄食量，观察记录动物生长与进食情况。动物室温度控制在22℃，相对湿度65% ～70%，实验期9 w。实验期间，正常对照组给予基础饲料，其余各组喂饲高脂饲料，芝麻素低、中、高剂量组分别给予芝麻素混悬液20、40、80 mg·kg－1·d－1灌胃。

1.2 标本采集与制备 实验9 w结束，处死大鼠取出肝脏并称重，部分肝脏用生理盐水漂洗数次后，滤纸拭干;称取1 g剪碎，加冰生理盐水至总体积为10 ml。用玻璃匀浆器在冰水中进行碾磨匀浆，制成10%匀浆。4 000 r/min、4℃离心3 min，取上清，测定相关指标。另取部分肝右叶，用10%甲醛固定，石蜡包埋，切片，HE染色，作肝脏病理组织学检查。

1.3 生化指标 用酶比色法测定肝匀浆TC、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)，试剂盒均由中生北控生物科技股份有限公司提供 。用硫代巴比妥酸(TBA)法测丙二醛(MDA)、用黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物歧化酶(SOD)，试剂盒均由南京建成生物研究所提供。以上指标严格按照试剂盒操作步骤测定。

1.4 分子生物学指标 RT-PCR方法检测肝组织CYP2E1 mRNA表达:①按Trizol试剂盒说明从大鼠肝脏中提取总RNA;②成髓细胞瘤病毒(AMV)反转录合成cDNA第一链;;③PCR扩增:引物及内参序列，见表1。CYP2E1扩增条件为94℃预变性3 min;94℃变性60 s，60℃退火60 s，72℃延伸60 s;30个循环，72℃ 8 min。取PCR产物约4μl，以1%琼脂糖凝胶电泳30～40 min，紫外灯下观察目的条带。凝胶成像分析系统成像后测定目的条带的积分光密度值，计算出目的基因与内参两者的积分光密度比，即为各基因表达的相对量。

1.5 统计学分析 应用SPSS13.0统计软件进行处理，数据以x±s表示，多组计量资料用单因素方差分析，用LST统计学方法进行多组间的两两比较。

表1 CYP2E1及内参(GADPH)核酸序列

2 结果

2.1 芝麻素对大鼠的体重和肝指数的影响 实验结束时，各组动物体重无统计学差异。高脂模型组与正常对照组相比肝指数升高(P＜0.05);芝麻素各剂量组与高脂模型组相比，肝指数均下降(P＜0.05);但芝麻素各剂量组之间无统计学差异。见表2。

2.2 肝脏病理变化 大体形态观察:正常组大鼠肝脏颜色鲜红，质地柔软，富有弹性;模型组大鼠肝脏体积明显增大，呈黄褐色，触之有油腻感，边缘饱满，质地稍韧;芝麻素各组大鼠肝脏体积较模型组略小，颜色呈较浅淡的黄褐色，质地、弹性和柔韧性较模型组略好。病理切片观察:正常对照组肝小叶结构完整、清晰，中央静脉大而壁薄，肝细胞排列成肝索，在中央静脉周围呈放射状排列;模型组大鼠肝组织见重度脂肪变(即脂肪变性的肝细胞占肝小叶2/3以上)，肝细胞体积增大，排列紊乱，索状结构不清，细胞内充满以大空泡为主的混合性空泡，部分伴肝细胞水样变，细胞核被挤向包膜;各实验组肝细胞脂肪变性程度明显减轻，表现为脂肪变性，肝细胞数目明显减少，胞浆内脂滴减少或消失，肝窦清晰可见，肝索排列整齐，无细胞坏死及炎细胞浸润，说明各干预因素均可以明显减轻肝脂肪变性的程度。见图1。

图1 各组肝脏病理组织观察(HE，×400)

2.3 芝麻素对大鼠肝脂的影响 高脂模型组较正常对照组TC、TG、LDL-C均升高(P＜0.05);芝麻素三个剂量组较高脂模型组TC、TG、LDL-C均下降(P＜0.05)。随芝麻素剂量增加TC、TG、LDL-C含量逐渐下降(P＜0.05)。见表3。

2.4 芝麻素对大鼠SOD、MDA的影响 高脂模型组较正常对照组SOD活力有所下降(P＜0.01)，芝麻素各剂量组SOD活力较高脂模型组均升高(P＜0.01)，且随芝麻素剂量增加SOD活力增加。高脂模型组较正常对照组MDA高(P＜0.01);芝麻素各剂量组MDA含量均低于高脂模型组(P＜0.01)，与正常对照组无差异，芝麻素各剂量组间也无差异。见表4。

表2 芝麻素对大鼠体重及肝指数的影响(x ± s，n=8)

表3 芝麻素对大鼠肝匀浆TC、TG和LDL的影响(mmol/L，x ± s，n=8)

2.5 芝麻素对CYP2E1 mRNA表达的影响 与正常对照组相比(0.846±0.026)，高脂模型组CYP2E1 mRNA表达水平显著增加(1.535±0.084，P＜0.05)，高、中、低剂量芝麻素各组CYP2E1 mRNA表达水平明显低于高脂模型组(0.801±0.017，0.795±0.016，0.881±0.046，P ＜0.05)。见图2。

表4 芝麻素对大鼠肝匀浆SOD、MDA的影响(x ± s，n=8)

图2 RT-PCR检测CYP2E1及GAPDH的表达

3 讨论

脂肪肝的发病机制比较复杂，至今尚未完全阐明。Day等〔3〕提出的“二次打击”学说在目前学术界得到较为普遍的认可。该学说认为初次打击主要为高脂饮食，胰岛素抵抗、瘦素抵抗等原因引起的肝脏脂肪代谢障碍。肝细胞脂肪变性是肝细胞对代谢障碍的适应性改变，同时也使肝细胞活性下降，对损伤的敏感性增加，且肝细胞内脂质的蓄积为氧应激脂质过氧化提供了足够的反应基质;二次打击是以氧应激脂质过氧化为主，活性氧大量生成，脂质过氧化伴细胞因子的活化，进而引起脂肪变性的肝细胞发生炎症、坏死、甚至纤维化。因此，兼有调脂和抗氧化双重作用的物质会更有利于脂肪肝的防治。

CYP450酶系在脂肪酸、TC的生物转化中起重要作用。既往关于它们与脂肪肝关系的研究较少，且结论不尽一致。研究表明CYP2E1在酒精性肝病的发病机制中主要参与脂质过氧化反应〔6，7〕，在 NAFLD 中也起重要作用〔8〕。动物实验表明，高脂饮食能使大鼠CYP2E1的活性显著升高，并能在转录前水平诱导CYP2E1 mRNA水平和蛋白表达增强〔9〕。但Wagner等发现CYP2E1的表达在高脂情况下并没有明显增强〔10〕。

本试验成功建立了NAFLD模型，并在高脂膳食的同时应用芝麻素进行干预。结果显示，芝麻素能降低肝组织中的脂质水平及肝指数，减少脂肪酸的生成，缓解脂代谢紊乱，改善脂肪肝损伤;同时，本研究中各实验组肝组织MDA低于模型对照组、SOD活力高于模型对照组，说明芝麻素通过减少脂质过氧化及发挥抗氧化作用抑制了脂质过氧化损伤，从而使肝脏免受损害。本研究高脂模型组大鼠肝组织CYP2E1 mRNA表达显著升高，说明CYP2E1 mRNA的增加使肝自由基产生增多，促进脂肪肝病变的进展。芝麻素能降低肝组织CYP2E1 mRNA的表达，提示芝麻素能有效减轻氧应激和脂质过氧化反应，增强肝内脂肪酸氧化，保护肝细胞。

综上所述，芝麻素能降低脂肪肝大鼠肝中脂质的含量，阻碍了初次打击对脂肪肝形成的作用;同时能显著增加SOD活性，抑制氧化代谢产物MDA含量，显著降低CYP2E1 mRNA的表达，因而能从提高机体抗氧化的能力，阻断第二次打击对肝细胞脂肪病变的进展。因而对NAFLD有一定的预防作用。

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3 Suja KP，Jayalekshmy A，Arumughan C.Free radical scavenging behavior of a ntioxidant compounds of sesame(sesamumindicum L)in DPPH system〔J〕.JAgric Food Chem，2004;52(4):912-5.

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5 汪五三，宋建国.芝麻素保肝作用实验研究〔J〕.中药药理与临床，2006;22(3、4):27-2.

6 林 青，李立纪，曹 东.抗脂肪肝研究的思考〔J〕.云南中医学院学报，2002;25(1):41-2.

7 Day CY，Jmaes OF.Hepatic steatosis:innocent bystander or guilty Party〔J〕?Hepatology，1998;27(6):1463-6.

8 Leeler G，Horsmnas Y，Desager JP，et al.Reduction in CYP activities is correlated to the degree of fat liver content in two animal models of nutritional steatosis〔J〕.Hepatology，1996;24:311.

9 Younossi ZM，Diehl AM，Ong JP.Nonalcoholic fatty liver disease:an agenda for clinical research〔J〕.Hepatology，2002;35(4):746-52.

10 Wagner BA，Buettner GR，Burns CP.Vitamin E slows the rate of free radical-mediated lipid peroxidation in cells〔J〕.Arch Biochem Biophys，1996;334(2):261-7.