史春艳 姚春丽

(长春市中心医院，吉林 长春 130062)

日光中的紫外线(utltraviolet，UV)辐射直接导致皮肤光老化。紫外线分为三个波段:UVA 320～400 nm，UVB 280～320 nm，UVC 200～280 nm〔1〕。UVC 一般被地面大气层中的氧及臭氧所吸收，主要导致皮肤损伤的是UVA和UVB。UVA对皮肤的穿透能力高于UVB，可深达皮肤基底层和真皮层，UVB作用于皮肤表皮层，是引起皮肤红斑和色素沉着及皮肤粗糙、多皱的主要因素〔2，3〕。

1 材料与方法

1.1 动物 健康Wistar大鼠30只，清洁级，体重(250±20)g，由吉林大学实验动物中心提供，随机分为对照组、模型组及MSCs治疗组，每组10只。

1.2 试剂与仪器 胎牛血清、L-DMEM培养基(GIBCO公司)，胰蛋白酶(SIGMA公司)，RNA提取试剂盒(北京博迈德公司)，倒置显微镜(日本Olympus)，凝胶成像系统、PCR仪(美国伯乐公司)。

1.3 骨髓间充质干细胞(MSCs)的分离、培养 无菌分离Wistar大鼠股骨，注射器吸取 L-DMEM培养基冲出骨髓，200μm滤网过滤成单细胞，以1×105/ml接种于培养瓶中，37℃、5%CO2饱和湿度条件下培养，传至第3代备用。

1.4 模型制备 电动剃须刀剔除大鼠背部5 cm×6 cm区域的毛发，采用15 W UVA和UVB紫外灯，置于大鼠背部裸露皮肤区的正上方35 cm处，每日照射2 h并观察大鼠皮肤变化，共照射60 d，对照组大鼠不做任何干预。

1.5 Ⅰ型、Ⅲ型胶原的表达 调细胞浓度为1×106/ml，在大鼠背部裸露皮肤区多点注射，1次/w，共8 w。颈椎脱臼处死各组动物，用锐利刀片取其背部照射区面积0.5 cm2大小的皮肤组织，采用RNA提取试剂盒提取RNA，根据GenBank的Ⅰ型、Ⅲ型胶原基因序列，以β-actin为内参照，设计、合成引物(见表1)，进行 RT-PCR 反应，50℃15 min，94℃2 min，94℃30 s，58℃、30 s，72℃1.5 min 30个循环。取PCR反应液5μl进行1.2%琼脂糖凝胶电泳，观察PCR扩增产物。

1.6 统计学分析 组间比较采用t检验。

2 结果

治疗组Ⅰ型胶原表达明显低于模型组，具有统计学意义(P＜0.05)。治疗组Ⅰ型胶原表达接近于对照组(P＞0.05)。治疗组Ⅲ型胶原表达高于模型组(P＜0.05)，但接近于对照组(P＞0.05)。表现出皮肤光老化早期改变的特征。即模型组Ⅰ型胶原显著增高，Ⅲ型胶原减少。见图1。

表1 RT-PCR检测中引物序列

图1 RT-PCR检测Ⅰ型、Ⅲ型胶原在各组的表达

3 讨论

成人皮肤中主要是Ⅰ型和Ⅲ型胶原，其中Ⅰ型胶原约占皮肤胶原干重的85%，是维持皮肤张力和承受拉力的重要成分，也是维持皮肤饱满充盈的物质基础。Ⅲ型胶原是幼稚、纤细的胶原纤维，是构成网状纤维的主要成分，在胚胎期占皮肤干重的50%。日光照射可影响I型胶原的形成，Ⅲ型胶原相对增加，最终导致成熟胶原束减少，皮肤出现松弛和皱纹。UV可使胶原发生改变，导致皮肤损伤〔4〕。UV照射可使真皮成纤维细胞功能受损，合成和分泌前胶原蛋白的能力下降，使MMP高表达，能特异性的降解几乎所有的细胞外基质成分，破坏胶原纤维和弹力纤维的正常结构。MMP在真皮中的堆积会加重真皮的氧化性损伤，进一步抑制成纤维细胞的增殖及胶原的合成〔5，6〕。

MSCs具有自我更新和多向分化潜能，MSCs可诱导转化为表皮样细胞;也观察到MSCs在体内外实验中参与真皮组织重建〔7，8〕。MSCs移植在损伤组织的重建及修复慢性损伤中均起着重要作用。MSCs多点注射治疗皮肤光老化发现，Ⅰ型胶原纤维相对含量减少，治疗组Ⅰ型胶原表达明显低于模型组;Ⅲ型胶原纤维的相对含量提高，治疗组Ⅲ型胶原表达高于模型组。提示MSCs移植后对皮肤光老化有治疗作用，其具体机制有待于进一步研究探讨。

1 Hajnoczky G，Csordas G，Madesh M，et al.Control of apoptosis by IP3 and ryanodine receptor driven calcium signals〔J〕.Cell Caleium，2000;28:349-63.

2 Cedar SH.The function of stem cells and their future roles in healthcare〔J〕.Br JNus，2006;15(2):104-7.

3 史春梦，程天民.大鼠真皮多能间充质干细胞的分离培养〔J〕.第三军医大学学报，2001;23(9):1068-70.

4 朱彦君，孟宇宏，冯光珍，等.紫外线照射后无毛鼠皮肤胶原的变化及其定量分析〔J〕.中华医学美学美容杂志，2005;11(3):159-62.

6 Wondrak GT，Roberts MJ，Cervantes-Laurean D，et al.Proteins of the extracellular matrix are sensitizers of Photo-oxidative stress in human skin Cells〔J〕.Invest Dermatology，2003;121(3):578-86.

7 Varani J，Spearman D，Perone P，et al.Inhibition of typeⅠprocollagen synthesis by damaged collagen in photoaged skin and by collagenase-degraded collagen in Vitro〔J〕.Am J Pathol，2001;158(3):931-42.

8 钟晓红，王明刚，赵李平，等.骨髓间充质干细胞在糖尿病模型创面中向表皮细胞分化的初步研究〔J〕.中国美容医学，2010;19(1):65-7.