侯 澍 张 磊 李红杰 胡林森

(首都医科大学附属北京世纪坛医院神经内科，北京 100038)

神经生长因子(NGF)是神经系统中最重要的生物活性物质之一，它掌控着神经元的生存、分化、生长发育、凋亡等重要生理功能，也参与受损神经的再生和功能修复〔1〕。本研究在建立NGF诱导PC12细胞分化模型的基础上，应用蛋白质组学技术筛选NGF诱导PC12细胞分化过程的结构相关蛋白，探索细胞形态变化的机制。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 PC12细胞购自中国科学院上海细胞库。DMEM购自Gibco公司。神经生长因子购自厦门北大之路生物工程有限公司。CyDye荧光标记物、24 cm固相pH梯度干胶条、胰蛋白酶、Clean-up试剂盒、2D Quant定量试剂盒等均购自GE Healthcare-Biosciences公司。谷氨酰胺、hACTH(19～39)和AngⅢ均购自美国Sigma公司。倒置相差荧光显微镜为日本O-lympus产品;蛋白质组学设备由GE Healthcare-Biosciences公司提供。

1.2 NGF诱导PC12细胞分化模型的建立 PC12细胞培养于DMEM培养基中(含10%新生牛血清、1%谷氨酰胺)，于37℃、5%CO2培养箱中培养。将同一批细胞分为实验组和对照组，按1×105个/ml密度接种，培养24 h后，在实验组中加入50 ng/ml NGF，而在对照组中加入等体积培养液。给药后分别于0、6、96 h进行吖啶橙和溴化乙啶染色，之后观察细胞形态的变化。

1.3 蛋白质组学分析 选取四批不同代数的细胞，培养24 h后，实验组加入NGF、对照组中加入培养液，再培养6 h或96 h。小心刮取细胞，2 000 r/min、4℃离心5 min，向沉淀中加入细胞裂解液，19 500 r/min、室温离心30 min，取上清。应用Clean-up试剂盒去除样品杂质，2D Quant定量试剂盒进行蛋白质定量。分别以1μl CyDye(Cy3、5)工作液标记相应的蛋白样品，用4μl Cy2工作液标记内标，冰浴避光30 min。按照蛋白质组学的操作说明，将3种荧光标记的样品混合在一起，上样至相应胶槽中，固相pH梯度干胶条放入胶槽，然后置于Ettan IPGphorⅡ等电聚焦电泳仪上，按自动程序进行水化与等电聚焦。经2次平衡，将IPG胶条转移至12.5%的SDS-PAGE胶上端，进行电泳。用Typhoon 9400激光扫描仪进行扫描，用DeCyder差异分析软件，找出蛋白表达差异点。

1.4 差异蛋白点的鉴定 从实验组和对照组中各取600μg蛋白，上述同样方法进行制备胶的制作，考马斯亮蓝染色。切取与差异表达点相匹配的蛋白点，用20 ng/μl胰蛋白酶将蛋白点于37℃酶切2 h。样品与等体积基质混匀后进行点样，将MALDI-TOF质谱仪所测的肽质量指纹谱数据输入NCBI蛋白质数据库进行检索。

2 结果

2.1 NGF作用下PC12细胞形态学变化 光镜下动态观察NGF作用下PC12细胞的形态学变化，对照组大多数PC12细胞呈圆形，散在生长或聚团生长，为未分化细胞(图1A);而在NGF作用6 h以后细胞开始长出神经突起(图1B);至96 h时细胞变得扁平，呈梭形或多角形，胞体增大，48%的细胞长出长突起，不同细胞的突起可连接成网(图1C)。

图1 对照组与NGF处理组PC12细胞的形态(吖啶橙和溴化乙啶染色，×200)

图2 NGF诱导PC12细胞分化晚期MALDI-TOF MS鉴定的细胞结构蛋白

2.2 NGF诱导6 h和96 h细胞差异表达的结构蛋白50 ng/ml NGF作用于PC12细胞6 h，提取全细胞蛋白，与对照组比较，质谱鉴定后，没有差异表达的结构蛋白被鉴定出来。

而用DeCyder BVA软件分析NGF诱导PC12细胞分化晚期(96 h)的细胞蛋白质表达量差异，并进行蛋白质鉴定，发现5种表达增高的结构蛋白质，在双向胶上分布见图2A，其中点A为神经丝蛋白-M(NF-M)，点B是神经丝蛋白-L(NF-L)，点C为微管蛋白α-2(tubulinα-2)，点D是微管蛋白β-15(tubulinβ-15)，点E为原肌球蛋白(TM)。

3 讨论

PC12细胞是大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤细胞，能合成、贮存并释放适量的儿茶酚胺。用NGF处理该细胞，可使其分化为交感神经元样细胞，从而在形态、生理、生化及功能方面更接近于神经元，是在分子水平上研究神经元分化的重要模型。

与传统生物化学方法相比，蛋白质组学是一种高通量、高分辨率的蛋白质研究方法，摈弃了对单一或少数蛋白质分割式的研究模式，使得在整体水平上研究细胞内蛋白质组成及其特有的活动规律成为可能，从而获得有关蛋白质性质、表达变化及翻译后修饰等方面的大规模信息。随着研究不断深入，蛋白质组学在解释诸如生长、发育、代谢调控等生命活动规律上将有所突破，也将为探讨重大疾病的发病机制、诊断和预防、新药开发提供重要的理论基础。本实验结果显示，NGF诱导PC12细胞分化96 h，神经丝蛋白(NF-M和NF-L)、微管蛋白tubulinα-2和tubulinβ-15以及TM这5种细胞骨架蛋白表达显著增高，而NGF诱导PC12细胞分化6 h，上述蛋白质表达与对照组比较均无变化。

微管是细胞骨架中最粗的一种纤维丝，是细胞内囊泡、细胞器和蛋白质交通运输的轨道。微管蛋白为球形分子，分为两种类型:α微管蛋白(α-tubulin)和β微管蛋白(β-tubulin)，这两种微管蛋白具有相似的三维结构，能够紧密地结合成二聚体，作为微管组装的亚基，能够聚合并且参与细胞分裂。β-tubulin有Ⅰ～Ⅵ六种亚型，其中Ⅱ、Ⅲ型是神经元特异性蛋白，在NGF作用于PC12细胞时其表达量增高数倍〔2〕。本实验中β-tubulin含量显著增高可能是Ⅱ、Ⅲ型β-tubulin表达上调所致。

NF是神经元特有的中间丝蛋白(10～12 nm)，分为NF-L、NF-M和NF-H三种不同类型。它们与其他中间丝蛋白相互聚合形成网络，主要起支持作用，是构成神经元骨架的主要成分。已有研究报道NGF诱导分化的PC12细胞中NF-L和NF-M表达增强〔3〕，这与本实验结果符合。

微丝为直径5～6 nm的双股螺旋细丝，由肌动蛋白、肌球蛋白、原肌球蛋白和辅肌球蛋白组成。本实验中，点E被鉴定为TM，它是上述微丝收缩过程中重要的调节蛋白质。Barbara等曾报道:脑源性神经营养因子(BDNF)作用于成神经细胞瘤细胞使TM-3上调，而NGF处理的TrkA-SY5Y细胞中该蛋白表达下调〔4〕。本实验中NGF处理组TM表达显著增高，这可能是由不同细胞系和不同实验条件所造成。TM上调与NGF引发的PC12细胞分化、细胞骨架蛋白表达增高等一系列现象相符，并可增强细胞的活动能力。

比较NGF处理6 h和96 h两组实验结果发现:NGF处理96 h时PC12细胞发生显著形态学变化，此时许多蛋白质表达发生显著变化。其中 NF-M、NF-L、tubulinα-2、tubulinβ-15和 TM等细胞结构蛋白表达显著上调，这与细胞形态学观察所见相符。这些差异主要反映了NGF形态学变化和细胞构成变化的一致性。本实验为研究NGF诱导PC12细胞分化的机制提供了线索，也为深入进行神经保护药物的研发提供了新的线索。

1 孙小单，李羽佳，佟晓杰.神经生长因子促进神经再生作用的研究进展〔J〕.辽宁医学院学报，2010;31(4):377-80.

2 Joshi HC，Cleveland DW.Differential utilization of beta-tubulin iso-types in differentiating neurites〔J〕.JCell Biol，1989;109:663-73.

3 Schimmelpfeng J，Weibezahn KF，Dertinger H.Quantification of NGF-dependent neuronal differentiation of PC-12 cells by means of neuro-filament-L mRNA expression and neuronal outgrowth〔J〕.J Neurosci Methods，2004;139(2):299-306.

4 Sitek B，Apostolov O，Stuhler K，et al.Identification of dynamic proteome changes upon ligand activation of Trk-receptors using two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis and mass spectrometry〔J〕.Mol Cell Proteomics，2005;4(3):291-9.