侯 澍 张 磊 李红杰 胡林森

(首都医科大学附属北京世纪坛医院神经内科，北京 100038)

神经生长因子(NGF)是神经系统中最重要的生物活性物质之一，它掌控着神经元的生存、分化、生长发育、凋亡等重要生理功能，也参与受损神经的再生和功能修复〔1〕。本研究在建立NGF诱导PC12细胞分化模型的基础上，应用蛋白质组学技术筛选NGF诱导PC12细胞分化过程的结构相关蛋白，探索细胞形态变化的机制。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 PC12细胞购自中国科学院上海细胞库。DMEM购自Gibco公司。神经生长因子购自厦门北大之路生物工程有限公司。CyDye荧光标记物、24 cm固相pH梯度干胶条、胰蛋白酶、Clean-up试剂盒、2D Quant定量试剂盒等均购自GE Healthcare-Biosciences公司。谷氨酰胺、hACTH(19～39)和AngⅢ均购自美国Sigma公司。倒置相差荧光显微镜为日本O-lympus产品;蛋白质组学设备由GE Healthcare-Biosciences公司提供。

1.2 NGF诱导PC12细胞分化模型的建立 PC12细胞培养于DMEM培养基中(含10%新生牛血清、1%谷氨酰胺)，于37℃、5%CO2培养箱中培养。将同一批细胞分为实验组和对照组，按1×105个/ml密度接种，培养24 h后，在实验组中加入50 ng/ml NGF，而在对照组中加入等体积培养液。给药后分别于0、6、96 h进行吖啶橙和溴化乙啶染色，之后观察细胞形态的变化。

1.3 蛋白质组学分析 选取四批不同代数的细胞，培养24 h后，实验组加入NGF、对照组中加入培养液，再培养6 h或96 h。小心刮取细胞，2 000 r/min、4℃离心5 min，向沉淀中加入细胞裂解液，19 500 r/min、室温离心30 min，取上清。应用Clean-up试剂盒去除样品杂质，2D Quant定量试剂盒进行蛋白质定量。分别以1μl CyDye(Cy3、5)工作液标记相应的蛋白样品，用4μl Cy2工作液标记内标，冰浴避光30 min。按照蛋白质组学的操作说明，将3种荧光标记的样品混合在一起，上样至相应胶槽中，固相pH梯度干胶条放入胶槽，然后置于Ettan IPGphorⅡ等电聚焦电泳仪上，按自动程序进行水化与等电聚焦。……