李树法 向 菲 李海英 黎姗姗 梁 愿 张 敏

(贵阳市第一人民医院内分泌科，贵州 贵阳 550002)

诱骗受体3(DcR3)是最近新发现的能与淋巴毒素类似物(LIGHT)、Fas配体(FasL)竞争性结合并抑制其活性的肿瘤坏死因子(TNF)家族成员之一，对LIGHT和Fas两大系统的调节起重要的作用〔1，2〕。DcR3抑制了LIGHT及FasL介导的凋亡，有助于肿瘤细胞、活化的自身免疫细胞免受机体免疫系统的清除，从而被认为与某些肿瘤、自身免疫病的发病有关，因此是一种具有免疫抑制作用的分子〔3～5〕。本研究拟将DcR3腺病毒转染到树突细胞(DC)表面，制备DcR3特异的DC疫苗，观察该疫苗对同种异体的CD8+T细胞的免疫抑制作用，为自身免疫疾病的治疗提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料 8月龄Balb/c和C57BL/6小鼠购自重庆医科大学动物实验中心。重组DcR3(Ad-DcR3)腺病毒和携带β-半乳糖苷酶(LacZ)基因的重组腺病毒(Ad-LacZ)由第三军医大学免疫学研究所提供，粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素-4(IL-4)和 TNF-α 购自美国 R＆D systems，Minneapolis。CD8+T细胞分离试剂盒购自Miltenyi公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠脾脏淋巴细胞悬液制备 颈椎脱臼法处死小鼠，无菌分离小鼠脾脏放于冷Hank液中，剪碎并反复碾磨通过200目的无菌铜网，收集悬液并用红细胞溶解液去除红细胞，再用大量Hank's液洗涤细胞2次，1 200 r/min离心10 min，用RPMI1640培养液重悬，计数。

1.2.2 免疫磁珠分选(MACS)纯化CD8+T细胞 取4×107细胞，1 200 r/min离心10 min，去上清液后用160μl缓冲液重悬，加40μl抗体Cocktail充分混匀，4℃孵育10 min。加160μl缓冲液，1 200 r/min离心10 min，去上清液，再加入320μl缓冲液、80μl磁性微珠，充分混匀，4℃孵育15 min。用适量缓冲液冲洗，1 200 r/min离心10 min。吸除上清液，用500μl缓冲液重悬细胞，200目筛网过滤成无气泡的单细胞悬液。将MS细胞分离柱置于MACS磁力架上，先用500μl缓冲液洗柱，再将细胞悬液通过MS柱，1 500μl缓冲液洗涤，收集流出液体，离心收集细胞，计数。

1.2.3 DC的培养及鉴定 取8周龄Balb/c小鼠，脱颈处死，用体积分数为75%的乙醇溶液浸泡5 min，无菌条件下切开皮肤及皮下组织，分离小鼠股骨和胫骨，用浓度为0.01 mol/L的无菌磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3～5次，剪断股骨和胫骨两端，用浓度为0.01 mol/L的无菌PBS反复冲洗骨髓腔，制成单细胞悬液，1 000 r/min离心 5 min去掉脂肪层，细胞用浓度为0.01 mol/L的无菌PBS重悬，再缓慢加入等体积Percoll细胞分离液，3 000 r/min离心 30 min，收集单核细胞，用浓度为0.01 mol/L的无菌PBS洗涤2次，再用含血清的DMEM培养基重悬，所得单细胞悬液接种于T-25培养瓶内，并补充GM-CSF和IL-4，置温度为37℃、CO2气体体积分数为5%和饱和湿度的培养箱内培养，隔日半量换液补充细胞因子，第7天收获细胞，即得DC。采用光镜观察DC的形态。

1.2.4 重组酶腺病毒对DC的体外转染 将DC置于6孔培养板中，每孔3×106个细胞，实验组每孔加入1×109Pfu的Ad-DcR3或Ad-LacZ重组腺病毒1 ml，空白对照组每孔加入1 ml PBS，在37℃5%CO2饱合湿度下继续培养48 h。

1.2.5 Western印迹检测DcR3蛋白的表达 收集感染48 h的各组细胞，提取总蛋白。取40μg蛋白样品进行12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)电泳，半干转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脱脂奶粉封闭2 h以封闭非特异反应物。封闭后的膜与1∶100稀释的DcR3一抗4℃孵育过夜。Tris缓冲液(TBS)洗膜，与1∶2 000稀释的二抗孵育120 h。TBS洗膜，化学发光试剂盒反应3 min，胶片曝光，拍照。实验中以β-actin作为内参。

1.2.6 混合淋巴细胞培养实验 采用混合淋巴细胞培养，取Balb/c的DC与C57BL/6的CD8+T细胞，调整细胞浓度为1×106个/ml，将两种细胞混合置于96孔培养板，每孔分别加入细胞各100μl，每组设3个复孔，置入37℃、5%CO2的孵育箱中，分别培养72 h。

1.2.7 淋巴细胞增殖能力检测 细胞混合培养后，每孔加入0.1 ml浓度为1×103μCi/L的3H-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)溶液，继续培养12 h，用PBS漂洗细胞3次，甲醛固定10 min，再用4℃预冷的体积分数为5%的三氯醋酸溶液漂洗3次，每孔加入0.5 ml浓度为0.3 mol/L的NaOH溶液，60℃水浴反应30 min，冷却至室温，转移入闪烁瓶中，加入5 ml闪烁液，用液体闪烁计数器计数每分钟的闪烁次数(cpm)，测定DPM值(反映细胞DNA合成速率)，重复测定3次。

1.2.8 细胞因子的ELISA检测 混合淋巴细胞培养72 h后，取培养上清液，用ELISA试剂盒检测培养液中的γ-干扰素(IFN-γ)水平。具体步骤参照试剂说明书。

1.3 统计学分析 采用SPSS统计软件对数据进行方差分析、t检验。

2 结果

2.1 DC的光镜观察结果 用光镜观察DC的形态，DC诱导成熟后，细胞呈不规则形，并形成大量的毛刺突出。证明经细胞因子诱导后，可以诱导脾脏单个细胞向DC的分化。见图1。

图1 DC的形态观察结果(×40)

2.2 细胞转染与Western印迹分析结果 将Ad-DcR3对DC进行转染，Western印迹分析DcR3的表达情况。Ad-DcR3可介导DcR3的有效表达，而阴性对照则未出现条带。见图2。

图2 Western印迹检测DcR3的表达

2.3 淋巴细胞增殖能力检测 Ad-DcR3组的CD8+T细胞cpm值为36 000±3 400，Ad-LacZ组为51 000±4 800，PBS组为54 000±6 500。实验证明转染Ad-DcR3的DC对同种异体的CD8+T细胞具有抑制增殖的作用(P＜0.05)。

2.4 淋巴细胞分泌IFN-γ的检测 Ad-DcR3组的CD8+T细胞 IFN-γ分泌值为(42.8±5.7)pg/ml，Ad-LacZ组为(98.4±11.9)pg/ml，PBS组为(96.5±10.2)pg/ml。实验证实转染Ad-DcR3的DC对同种异体的CD8+T细胞具有抑制细胞因子分泌的作用。

3 讨论

DcR3属于TNF受体(tumor necrosis factor receptor，TNFR)超家族的成员，其开放阅读框编码300个氨基酸。其基因定位于20q13.3，含有4个半胱氨酸富集区〔6〕。它是一种表面受体，也是一种凋亡抑制蛋白(IAP)，DcR3的配体均是TNF家族成员，包括FasL、LIGHT和TL1A。它可干扰FasL或淋巴毒素β受体介导的凋亡，还可通过阻断NFR-2和LIGHT之间的双向信号转导、TL1A致死亡受体3(death receptor3，DR3)的单向信号转导，抑制T细胞共刺激〔7～9〕。因而DcR3在肿瘤逃逸及转移、自身免疫性疾病、移植排斥反应中扮演了重要的角色，可为这些疾病的诊断、治疗、疗效观察和预后判断提供新的思路，故逐渐受到人们的重视。

DC是目前体内功能最强大的专职抗原递呈细胞，是机体T细胞特异免疫应答的直接启动和调控者〔10，11〕，其强大的专职性递呈作用和启动初始T细胞的能力，日益成为国内外学者研究的热点。它最大的特点是能够显著刺激初始型T细胞增殖活化〔11～13〕，因此DC是机体免疫反应的始动者，在免疫反应的诱导中具有独特的地位。采用基因修饰方法制备DC疫苗用于主动免疫治疗是一种理想的免疫治疗方法〔14，15〕。

为了证实DcR3基因修饰DC的免疫效应，本研究将该基因修饰的DC刺激同种异体的CD8+T细胞，采用3H-TdR和ELISA法检测DC对CD8+T细胞的免疫抑制情况。结果提示DcR3基因修饰DC能抑制同种异体的CD8+T细胞的增殖和细胞因子(IFN-γ)的分泌。因此，重组DcR3腺病毒转染的DC对CD8+T细胞具有免疫抑制效应，为下一步在自身免疫疾病的防治研究工作提供了工具和理论基础。

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