李树法 向 菲 李海英 黎姗姗 梁 愿 张 敏

(贵阳市第一人民医院内分泌科，贵州 贵阳 550002)

诱骗受体3(DcR3)是最近新发现的能与淋巴毒素类似物(LIGHT)、Fas配体(FasL)竞争性结合并抑制其活性的肿瘤坏死因子(TNF)家族成员之一，对LIGHT和Fas两大系统的调节起重要的作用〔1，2〕。DcR3抑制了LIGHT及FasL介导的凋亡，有助于肿瘤细胞、活化的自身免疫细胞免受机体免疫系统的清除，从而被认为与某些肿瘤、自身免疫病的发病有关，因此是一种具有免疫抑制作用的分子〔3～5〕。本研究拟将DcR3腺病毒转染到树突细胞(DC)表面，制备DcR3特异的DC疫苗，观察该疫苗对同种异体的CD8+T细胞的免疫抑制作用，为自身免疫疾病的治疗提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料 8月龄Balb/c和C57BL/6小鼠购自重庆医科大学动物实验中心。重组DcR3(Ad-DcR3)腺病毒和携带β-半乳糖苷酶(LacZ)基因的重组腺病毒(Ad-LacZ)由第三军医大学免疫学研究所提供，粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素-4(IL-4)和 TNF-α 购自美国 R＆D systems，Minneapolis。CD8+T细胞分离试剂盒购自Miltenyi公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠脾脏淋巴细胞悬液制备 颈椎脱臼法处死小鼠，无菌分离小鼠脾脏放于冷Hank液中，剪碎并反复碾磨通过200目的无菌铜网，收集悬液并用红细胞溶解液去除红细胞，再用大量Hank's液洗涤细胞2次，1 200 r/min离心10 min，用RPMI1640培养液重悬，计数。

1.2.2 免疫磁珠分选(MACS)纯化CD8+T细胞 取4×107细胞，1 200 r/min离心10 min，去上清液后用160μl缓冲液重悬，加40μl抗体Cocktail充分混匀，4℃孵育10 min。加160μl缓冲液，1 200 r/min离心10 min，去上清液，再加入320μl缓冲液、80μl磁性微珠，充分混匀，4℃孵育15 min。用适量缓冲液冲洗，1 200 r/min离心10 min。吸除上清液，用500μl缓冲液重悬细胞，200目筛网过滤成无气泡的单细胞悬液。……