庄秋红 李 譞 赵学忠

(吉林省武警总队医院，吉林 长春 130062)

血管平滑肌细胞(VSMC)是构成血管壁的重要成分，其增殖和凋亡的失衡可以导致动脉粥样硬化(AS)和PCI术后管腔再狭窄。有研究证明钙通道阻滞剂(CCB)类药物有抗AS作用。盐酸地尔硫艹卓(合贝爽)是CCB中地尔硫艹卓类药物，本实验应用合贝爽抑制血管紧张素(Ang)Ⅱ诱导的VSMC增殖，并观察其对凋亡基因的影响，旨在探讨合贝爽有无抗AS作用。

1 材料与方法

1.1 细胞培养、鉴定及分组 清洁级Wistar大鼠在无菌操作条件下取胸主动脉中层加入RPMI1640培养液，采用贴块法培养，放入CO2孵箱培养，于倒置显微镜下观察细胞生长情况，待单层细胞生长近培养瓶底80%以上时可传代。实验中采用4～6代VSMC。采用兔抗大鼠平滑肌肌动蛋白(α-SMA)对动脉平滑肌细胞进行肌动蛋白免疫组化染色，鉴定其是否为VSMC。

将 4～6代 VSMC随机分为空白组、模型组(AngⅡ10－7mol/L)、模型 +合贝爽1组(合贝爽10－5mol/L)、模型 +合贝爽2组(合贝爽10－6mol/L)、模型+合贝爽3组(合贝爽10－7mol/L)，以上各组培养48 h。

1.2 方法

1.2.1 细胞增殖能力测定 采用MTT法检测VSMC的生长率，各组细胞加入MTT溶液，37℃继续培养4 h后终止培养，加入二甲基亚砜(DMSO)，振荡10 min，选择490 nm波长，在酶标仪上测定各孔吸光度值。

1.2.2 原位细胞凋亡染色 各组细胞爬片用40% 多聚甲醛室温固定30 min，放入0.3%H2O－2甲醇中30 min封闭，放入0.1%TritonX-100枸橼酸钠缓冲液中冰浴2 min，加25μl的TUNEL反应混合液，在湿盒中37℃反应60 min，加25μl转化剂，在湿盒中37℃孵育30 min，加入DAB底物溶液，室温孵育10 ～30 min，复染核，脱水、透明、封片、镜检。

1.2.3 RT-PCR 法检测细胞内 Bcl-2、Bax、Fas、P53 mRNA 的表达情况

1.2.3.1 各组VSMC中总RNA提取 VSMC中加入1 ml Trizol试剂，轻轻摇动至细胞裂解、液体变黏，加入0.2 ml氯仿，离心后取上层水相加入0.5 ml异丙醇，室温下放置10 min后混匀，离心后沉淀中加入75%乙醇1 ml洗涤1次，离心后沉淀干燥10 min，沉淀重悬于DEPC水中。

1.2.3.2 反应体系及循环参数 (1)总RNA逆转录反应:等量取上述每个标本总RNA 1μg，分别逆转录成cDNA。反应体系(20 μl):RNA 10 μl、Oligo dT 1 μl，90℃水浴5 min，置于冰上2 min，后续加 M-MLV 1 μl、dNTP 2 μl、RNase抑制剂0.5 μl、双蒸水 5.5 μl，42℃水浴 60 min，95℃水浴 5 min，置于 4℃保存。(2)PCR反应体系(50μl)10×PCR缓冲液5μl、MgCl25μl、dNTP 1μl、目的基因上游、下游引物各1 μl、Tap DNA 酶1 μl、样本cDNA 2μl、重蒸水32μl。反应条件:95℃变性30 s，57℃退火45 s，72℃延伸 60 s，循环30次。

1.2.3.3 电泳分离、结果测定 取PCR产物于2%琼脂糖凝胶上电泳，紫外分析仪下观察，并拍照记录结果，每份样品的GAPDH扩增带均应阳性。

1.3 统计学分析 各组数据均以x±s表示，组间比较采用样本均数的方差分析。

2 结果

2.1 VSMC的鉴定 采用α-SMA免疫组化染色，结果显示＞98%的细胞染色呈阳性，即细胞质内呈棕黄色反应，胞核不着色，表明细胞含有肌动蛋白，证实为VSMC。见图1。

2.2 合贝爽对VSMC增殖能力的影响 模型组生长率比空白组明显升高，两者存在显著差异(P＜0.05)，提示AngⅡ促进VSMC增殖;合贝爽1、2、3组生长率均比模型组显著降低，有显著差异(P＜0.05)，并与剂量相关，提示合贝爽有抑制AngⅡ促进的VSMC增殖的作用。见表1。

2.3 合贝爽对VSMC凋亡的影响 TUNEL染色阳性细胞表现为细胞核呈棕黄色着色，细胞质不着色。在400倍显微镜下计数阳性细胞的个数，阳性细胞数/视野内细胞总数即为凋亡率。合贝爽1、2、3组凋亡率比模型组增高，有显著差异(P＜0.05)，并与剂量相关，提示合贝爽有促进VSMC凋亡的作用。见表1。

2.4 合贝爽对 VSMC Bcl-2、Bax、Fas、P53基因表达的影响合贝爽1、2、3组Bcl-2 mRNA的表达量比模型组减少，有显著差异(P＜0.05)，说明合贝爽对Bcl-2的表达有抑制作用。合贝爽1、2、3组Bax、Fas mRNA的表达量比模型组增多，有显著差异(P＜0.05)，说明合贝爽对Bax、Fas的表达有促进作用。合贝爽1、2组P53 mRNA的表达量比模型组增多，合贝爽3组P53 mRNA的表达量与模型组比较无统计学意义，说明合贝爽对P53的表达有促进作用。见表2和图2。

表1 不同浓度合贝爽对AngⅡ诱导的VSMC增殖及凋亡率的影响(x ± s，n=8)

表2 各组VSMC Bcl-2、Bax、Fas、P53 mRNA的表达情况(x ± s，n=3)

图1 VSMCα-SMA免疫组化染色(×200)

图2 各组 VSMC Bcl-2、Bax、Fas、P53 mRNA 的表达

3 讨论

VSMC是构成血管壁的重要成分，其过度增殖、凋亡减少是动脉粥样硬化(AS)和PCI术后管腔再狭窄形成的重要步骤〔1〕。因此开发安全有效的促进VSMC凋亡、抑制增殖的药物具有重要临床意义。合贝爽(herbesser)通用名为地尔硫艹卓，主要作用为抑制平滑肌细胞收缩，扩张冠状动脉，用于治疗不稳定型心绞痛。本实验结果显示合贝爽能使VSMC生长率降低，凋亡率增加，说明合贝爽可能有抑制VSMC的增殖、促进VSMC凋亡的作用。

本实验显示合贝爽抑制抗凋亡Bcl-2的表达，促进促凋亡基因Bax、Fas、P53的表达。Bcl-2是抗凋亡基因，通过阻止线粒体膜上通透性孔道的开放，阻止线粒体细胞色素C的释放，抑制caspase-9的激活;中和促进凋亡的蛋白和引起细胞核谷胱苷肽(GSH)积聚，导致核内氧化还原平衡的改变，从而降低caspase的活性，最终抑制 VSMC 的凋亡〔2〕。Bax、Fas、P53 是促凋亡基因，通过激活线粒体途径和死亡受体途径，最终导致VSMC凋亡的发生。Bax在细胞内超表达，形成同源二聚体多，Bax与Bcl-2形成异源二聚体减少，与Bax分离的Bcl-2增多，使Bcl-2失去了抗凋亡能力，细胞对死亡信号的反应增强〔3〕。P53是Bax的正调因子、Bcl-2的负调因子，Bcl-2/Bax的减少使细胞色素C从线粒体中释放出来，近而导致快速的caspase级联反应，最后导致线粒体介导的细胞凋亡〔4〕。P53还可以改变死亡受体的分布，使其由细胞质转移到细胞表面，增加细胞对死亡受体介导的细胞凋亡的敏感性〔5〕。Fas是死亡受体家族的重要成员，Fas与Fas配体蛋白在细胞膜上结合后，触发自身三聚化，激活caspase-3，caspase-3水解多种蛋白如内源性DNA酶、细胞骨架成分，最终引发细胞凋亡〔6〕。

综上所述，合贝爽可能通过抑制抗凋亡基因Bcl-2表达，促进促凋亡基因Bax、Fas和P53表达，使VSMC凋亡增加，抑制VSMC增殖。VSMC增殖减少使血管壁细胞数量减少、内膜变薄、管腔狭窄减轻，减少了细胞因子的释放和基质降解酶和促血栓分子的表达，延缓或逆转了AS的发展〔7〕。VSMC增殖的减少延缓了其向内膜下迁移，减少了细胞外基质的合成，防治了PCI术后再狭窄的发生〔8〕。

1 Rose R.Atherosolereosis-an inflammatory disease〔J〕.N Eng J Med，1999;340(2):115-26.

2 Pinton P，Ferrari D，Papizzi Z，et al.The Ca2+concentration of the endoplasmic reticulum is a key determinant of ceramide-induced apoptosis:significance for the molecular mechanism of Bcl-2 action〔J〕.EMBO J，2001;20:2690-701.

3 Schendel SL，Xie ZH，Montal MO，et al.Channel formation by anti-apoptotic protein Bcl-2〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，1997;13:1899-911.

4 vanden Abeele F，Skryma R，Shuba Y，et al.Bcl-2-dependent modulation Ca2+homeostasis and store-operated channels in prostate cancer cells〔J〕.Cancer Cell，2002;1(2):169-79.

5 Wu GS，Burns TF，McDonald ER，et al.KILLER/DR5 is a DNA damageinducible P53-regulated death receptor gene〔J〕.Nat Genet，1997;17(2):141-3.

6 Chan SW，Hegyi L，Scott S，et al.Sensitivity to Fas-mediated apoptosis is determined below receptor level in human vascular smooth muscle cells〔J〕.Circ Res，2000;86:1038-52.

7 Rivaed A，Andres V.Vascular smooth muscle cell proliferation in the pathogenesis of atherosclerotic cardiovascular diseases〔J〕.Histol Histopathol，2000;16:557-71.

8 Ross R，Glomset JA.The pathogenesis of atherosclerosis〔J〕.N Engl J Med，1996;295:420-5.