庄秋红 李 譞 赵学忠

(吉林省武警总队医院，吉林 长春 130062)

血管平滑肌细胞(VSMC)是构成血管壁的重要成分，其增殖和凋亡的失衡可以导致动脉粥样硬化(AS)和PCI术后管腔再狭窄。有研究证明钙通道阻滞剂(CCB)类药物有抗AS作用。盐酸地尔硫艹卓(合贝爽)是CCB中地尔硫艹卓类药物，本实验应用合贝爽抑制血管紧张素(Ang)Ⅱ诱导的VSMC增殖，并观察其对凋亡基因的影响，旨在探讨合贝爽有无抗AS作用。

1 材料与方法

1.1 细胞培养、鉴定及分组 清洁级Wistar大鼠在无菌操作条件下取胸主动脉中层加入RPMI1640培养液，采用贴块法培养，放入CO2孵箱培养，于倒置显微镜下观察细胞生长情况，待单层细胞生长近培养瓶底80%以上时可传代。实验中采用4～6代VSMC。采用兔抗大鼠平滑肌肌动蛋白(α-SMA)对动脉平滑肌细胞进行肌动蛋白免疫组化染色，鉴定其是否为VSMC。

将 4～6代 VSMC随机分为空白组、模型组(AngⅡ10－7mol/L)、模型 +合贝爽1组(合贝爽10－5mol/L)、模型 +合贝爽2组(合贝爽10－6mol/L)、模型+合贝爽3组(合贝爽10－7mol/L)，以上各组培养48 h。

1.2 方法

1.2.1 细胞增殖能力测定 采用MTT法检测VSMC的生长率，各组细胞加入MTT溶液，37℃继续培养4 h后终止培养，加入二甲基亚砜(DMSO)，振荡10 min，选择490 nm波长，在酶标仪上测定各孔吸光度值。

1.2.2 原位细胞凋亡染色 各组细胞爬片用40% 多聚甲醛室温固定30 min，放入0.3%H2O－2甲醇中30 min封闭，放入0.1%TritonX-100枸橼酸钠缓冲液中冰浴2 min，加25μl的TUNEL反应混合液，在湿盒中37℃反应60 min，加25μl转化剂，在湿盒中37℃孵育30 min，加入DAB底物溶液，室温孵育10 ～30 min，复染核，脱水、透明、封片、镜检。

1.2.3 RT-PCR 法检测细胞内 Bcl-2、Bax、Fas、P53 mRNA 的表达情况

1.2.3.1 各组VSMC中总RNA提取 VSMC中加入1 ml Trizol试剂，轻轻摇动至细胞……