陈 凯 刘浩然 苏燕慧 喻苏青 齐敏友

(浙江工业大学，浙江 杭州 313000)

衰老的特征之一为性腺功能的退化〔1，2〕。从50岁开始，男性睾丸组织就出现退行性变化;睾丸重量减轻，生精细胞散在分布或者缺无，支持细胞稀少，间质细胞随年龄递减，血清睾酮水平下将〔3，4〕。以D-半乳糖皮下注射可造成实验动物快速衰老，在性腺的损伤方面可表现出与自然衰老相似的特征〔5〕。淫羊藿是传统的补肾药，淫羊藿苷是其主要的有效成分之一，目前研究表明，其可明显促进幼年小鼠附睾及精囊的发育〔6〕。本实验以D-半乳糖造成小鼠衰老模型，观察淫羊藿苷对衰老小鼠睾丸组织特异性酶类、氧化应激指标的改变，并从病理组织学观察其对睾丸病变的影响，了解淫羊藿苷对衰老小鼠睾丸病变的作用，为其防治男性睾丸病变提供药理学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 健康雄性昆明种小鼠32只，体重(20±2)g。由浙江医学科学院实验动物中心提供。合格证号:SCXK(浙)2008-0033。

1.1.2 药物、试剂及仪器 淫羊藿苷(规格:98%，HPLC)，由西安小草植物科技有限公司提供，淡黄色粉末;D-半乳糖(Amresco)分装，南京生兴生物技术有限公司提供。考马斯亮蓝测试盒、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、乳酸脱氢酶(LDH)、酸性磷酸酶(ACP)、谷氨酰转肽酶(γ-GT)试剂盒，由南京建成生物工程有限公司提供。睾酮检测试剂盒，由天津九鼎生物工程有限公司提供。紫外分光光度计、离心沉淀机(巩义市英峪予华仪器厂)、电子天平(型号104，Made by Mettler-Toledo Group)、恒温水浴箱(型号 WB22，Made in German)。

1.2 方法

1.2.1 D-半乳糖致衰老小鼠睾丸退行性病变模型的制作及分组 雄性小鼠每日皮下注射予200 mg/kg的D-半乳糖1次，连续30 d造成衰老模型。将造模小鼠分为模型组、淫羊藿苷高、低剂量组，另加一组正常小鼠为对照，正常对照组皮下给予相同体积的生理氯化钠溶液。造模30 d后，正常组与模型组给予0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)口服。其余两组分别给予淫羊藿苷(口服，50、100 mg/kg)。药物混悬于0.5%CMC-Na中，每日给药1次，连续20 d。

1.2.2 脏器系数 处死动物，取出睾丸、附睾、精囊腺，精密称重并计算脏器指数(脏器重量/体重量)。

1.2.3 生化检测 取血清以放射免疫法检测睾酮。取右侧睾丸组织以生理盐水制成匀浆，检测 SOD、MDA、LDH、ACP、γ-GT的活性。

1.2.4 组织学检测 取左侧睾丸组织以4%多聚甲醛固定，沿其长轴垂直于曲细精管走向剖开，经石蜡包埋切片，苏木素-伊红(HE)染色，于光镜下观察。

1.3 统计学处理 应用SPSS10.0统计学分析软件进行统计学处理，数据以x±s表示。采用单因素方差分析，并作组间两两比较。

2 结果

2.1 淫羊藿苷对性腺及附性器官脏器指数的改善 模型组睾丸脏器系数较对照组降低，随着药物浓度的增加，接近正常水平，提示淫羊藿苷治疗组脏器系数都有所增大(P＜0.05或0.01)。见表1。

表1 淫羊藿苷对睾丸脏器系数的影响(x ± s，n=8)

2.2 淫羊藿苷对睾丸组织SOD和MDA活性的影响 衰老模型组与对照组相比，其睾丸SOD显著降低(P＜0.01)，而MDA含量显著升高(P＜0.05)，显示出机体抗氧化能力下降，而脂质过氧化产物增多。淫羊藿苷组都能不同程度地提高衰老小鼠睾丸SOD活性，同时降低MDA含量(P＜0.05或0.01)，呈现量效关系。见表2。

表2 淫羊藿苷对大鼠睾丸组织SOD和MDA的影响(x ± s，n=8)

2.3 淫羊藿苷对睾丸特异性酶ACP、γ-GT、LDH活性的影响

造模30 d后，模型组相对于正常组均下降(P＜0.05或0.01)。高浓度淫羊藿苷治疗组ACP、γ-GT、LDH活性相对于模型组上升41.43%、64.47%、36.14%(P＜0.05或P＜0.01)。见表3。

2.4 淫羊藿苷对血清睾酮的影响 模型组小鼠血清睾酮水平〔(10.32±1.03)nmol/L〕相比对照组明显下降〔(19.57±1.68)nmol/L〕(P ＜ 0.01)，淫 羊 藿 苷 50、100 mg/kg 组〔(13.73±1.22)nmol/L，(15.69±1.04)nmol/L〕有明显改善(P ＜0.01)。

表3 淫羊藿苷对特异性酶ACP、γ-GT、LDH活性的影响(x ± s，n=8，U/g)

2.5 淫羊藿苷对睾丸组织结构的影响 睾丸组织HE染色，于光镜下观察。结果表明:正常组小鼠睾丸各级生精细胞丰富，生精细胞与支持细胞排列有序;D-半乳糖致衰老模型组睾丸各级生精细胞显著减少，支持细胞少，甚至成空泡，细胞排列紊乱。淫羊藿苷低剂量组生精细胞相对模型组增多，排列稀疏;淫羊藿苷高剂量组生精细胞相对模型组增多，排列较为整齐，与正常组较为接近。见图1。

图1 淫羊霍苷对D-半乳糖模型小鼠睾丸组织结构的作用(HE，×100)

3 讨论

D-半乳糖致衰老模型是目前应用最多的衰老模型之一，连续给动物注射大剂量D-半乳糖后使机体细胞内半乳糖浓度升高，在醛糖还原酶的催化下还原成半乳糖醇，其不能被细胞进一步代谢而堆积在细胞内影响正常的渗透压，从而导致细胞肿胀和功能障碍，细胞发生凋亡，最终致使衰老的发生〔7〕。全身性的衰老使得下丘脑-垂体-性腺轴(HPG)功能减退〔8〕，睾丸逐步出现退行性病变，睾酮分泌减少，精子数目减少，性欲减退〔9〕。

睾丸中特异性酶在精子发生与成熟过程中也起重要作用。ACP主要位于支持细胞和精子的溶酶体内，其作用是清除受损或衰老细胞，保持机体的正常代谢和生理功能，其活力的高低可作为衡量是否有生精障碍的指标，LDH促进能量代谢及生精上皮的成熟，而γ-GT则为精子的成熟提供酸性环境〔10〕。本次研究提示淫羊藿苷可以保护酶的活力，防止各级生精细胞，生精上皮的损伤，促进生精细胞能量的生成，从而对衰老模型小鼠睾丸的病变有保护作用。

睾酮水平对精子发生和成熟有着重要的生理作用，睾丸内的睾酮释放后，被选择性地输送到曲细精管中，与曲细精管Sertoli细胞内的雄激素受体及管腔中的雄激素结合蛋白结合，促使精子发生和成熟。衰老可以使睾丸逐步出现退行性病变，睾酮分泌减少，本实验中衰老模型小鼠血清睾酮明显减少，淫羊藿苷能在一定程度上恢复睾丸的功能，促进睾酮的分泌。另外，氧化应激参与了衰老的发生，本次实验结果显示:模型组的生成酶系MDA过多，体内清除活性氧的酶系SOD降低，说明D-半乳糖致衰老模型小鼠睾丸中氧化应激状态增强，加重了睾丸病变的损伤，而淫羊藿苷显示具有较好的抗氧化能力。

淫羊藿是传统的补肾药，具有补肾壮阳、强筋骨、祛风湿作用，广泛用于不孕、不育、性功能障碍以及风湿病的治疗。淫羊藿苷是淫羊藿主要的有效成分之一，本研究结果表明:淫羊藿苷对上述睾丸退行性病变有明显的改善，其作用呈剂量依赖性。其作用机制可能与睾丸抗氧化作用及促进睾酮分泌有一定的关系。

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6 王正引，张小如，周林瑛，等.补肾健脾养血活血方对老年小鼠睾丸超微结构的影响〔J〕.中国医药学刊，2008;26(2):315-6.

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9 Hochreiter WW，Ackermann DK，Brutsch HP.Andropause〔J〕.Ther Umsch，2005;62(12):821-6.

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