兰咏梅 韩 涛 王佳蕾

(西北民族大学医学院，甘肃 兰州 730030)

肝星状细胞(Hepatic stellate cells，HSC)是目前研究肝纤维化(HF)发生机制中最受重视的细胞。目前认为，肝细胞坏死能激活HSC并使之增殖。HSC活化是HF最终的共同通路，是HF发生的细胞学基础。消痰化瘀抗纤方(简称“抗纤方”)在临床应用10余年，收到良好效果。本课题组在以往临床应用基础上，用细胞分子生物学方法探讨抗纤方防治HF的作用机制，为中医药防治HF的临床研究提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 肝星状细胞株HSC-T6，购于首都医科大学附属北京友谊医院肝病研究中心，为SV40转染SD大鼠HSC。

1.1.2 动物 SD大鼠，30只，180～220 g，SPF级，雌雄各半，由甘肃中医学院科研实验中心提供，实验动物质量合格证许可证号:SCXK(甘)2004-0006。

1.1.3 药物 抗纤方由瓦楞子、当归、茵陈、青皮等七味中药组成，购自甘肃中医学院附属医院中药房。复方鳖甲软肝片(福瑞中蒙药科技股份有限公司，批准文号:Z19991011)。

1.1.4 主要试剂与仪器 DMEM培养基干粉(美国，Gibco公司)，胰蛋白酶(美国，Amresco公司)，胎牛血清(杭州四季青生物制品公司)，L-谷氨酰胺、MTT、DMSO(美国，Sigma公司)。CO2培养箱(日本，SANYO公司)，净化工作台(上海新苗医疗器械制造有限公司)，荧光倒置生物显微镜(麦克奥迪)，酶标仪(美国，BIO-RAD公司)，凝胶成像分析仪(上海天美科学仪器有限公司)，紫外分光光度计、TC-512型 PCR仪(英国TECHNE公司)。

1.2 方法

1.2.1 药物血清制备

1.2.1.1 抗纤方水煎液制备 根据人与大鼠间的体表面积换算法〔1〕得到大鼠抗纤方水煎液所需高浓度(11.542 g/ml)，相当于成人(70 kg)每日1剂服用量的13.5倍。将中药材用三级水清洗2遍，加入三级水1 400 ml，浸泡30 min，加热沸腾后煎煮30 min，煎煮2次;第二煎加水700 ml，两次煎液过滤合并共900 ml〔2〕浓缩至11.542 g/ml。将此液体分别用一级水稀释到相当于成人每日1剂服用量的1.5、4.5倍，分别含生药1.282、3.848 g/ml。

1.2.1.2 复方鳖甲软肝片水溶液制备 将药物研磨为极细粉末，与成人正常服用剂量相当，一级水溶解，制成混悬液，浓度54 mg/ml。

1.2.1.3 含药血清制备〔3〕取SD大鼠30只，采用随机数字法分为5组，每组6只，雌雄各半。分别为正常血清组、复方鳖甲软肝片组(软肝片组)、抗纤方高剂量(13.5倍)组、中剂量(4.5倍)组、低剂量(1.5倍)组。除正常血清组灌胃等量0.9%NaCl注射液，其余各组灌胃相应浓度的药物，分2次灌服，连续6 d。第6天晚，开始禁食，不禁水，第7天按常规量灌胃1次，2 h后，腹腔注射麻醉，股动脉采血，室温静置4 h，3 000 r/min，15 min，离心分离血清。将同一组动物相同条件下所采血清混合，56℃水浴中灭活30 min，0.22μm微孔滤膜过滤，密封后－20℃冷藏保存备用。临用前加入DMEM培养液，配成含10%药物血清的培养液。

1.2.2 细胞基本实验

1.2.2.1 细胞培养和传代 采用含10%胎牛血清的DMEM培养液，在37℃，5%CO2及饱和湿度下培养。5～7 d后，当细胞相互接近呈单层致密状时，倒掉培养瓶中的培养液，用PBS清洗细胞，去除残留含血清培养液〔4〕。加入0.125%胰蛋白酶2 ml消化，静置5 min，在显微镜下观察。当细胞的形状模糊趋向于球形，倒掉胰蛋白酶，加入含血清的DMEM培养液10 ml终止消化，吹打瓶壁上的细胞成悬液，1 000 r/min，5 min，离心，去除上清液，收集细胞沉淀，加入新的含10%胎牛血清的培养液，用吸管吹打使之重新形成细胞悬液，接种传代。

1.2.2.2 细胞冻存和复苏 用胰蛋白酶把单层生长的对数生长期细胞消化下来，依据传代的方法把消化好的细胞收集于离心管离心。收集细胞沉淀，加入配制好的细胞冻存液，吹打均匀，分装入无菌冻存管中，每管1 ml。将用封口膜封好的冻存管液氮冻存。复苏时将冻存管迅速从液氮中取出，直接投入37℃水浴中，轻轻摇动使其尽快融化。开启冻存管，加入培养液与细胞悬液混合，低速离心，去除含DMSO的上清液，用生长培养液稀释，接种于培养瓶，放入CO2培养箱中培养。

1.2.2.3 细胞计数 首先用吸管吹打形成单细胞悬液，在血细胞计数板上盖玻片一侧加微量的细胞悬液，在显微镜下观察计数板四角大方格中的细胞数。细胞压中线时，只计左侧和上方者，不计右侧和下方者。根据公式计算得出细胞密度:细胞密度(个/ml原液)=(4个大格细胞数之和/4)×104。

1.2.3 细胞增殖实验 以MTT比色法〔5，6〕检测HSC的增殖。传代培养的HSC，取处于对数生长期细胞，消化为单细胞悬液，通过细胞计数，向细胞中加入含10%胎牛血清的DMEM培养液调整细胞浓度为1×105个/ml。细胞接种于96孔培养板中，每孔100μl，培养24 h后弃上清，换为10%含药血清培养液培养细胞，进行以下分组实验，每组设6个复孔。1组:正常血清组;2组:软肝片组;3组:抗纤方高剂量组;4组:抗纤方中剂量组;5组:抗纤方低剂量组。分别在培养箱中培养24、48、72 h后，在显微镜下观察细胞生长情况，每孔加入MTT溶液10μl，置37℃培养箱中继续孵育4 h，终止培养，小心弃去孔内培养上清液，每孔加入100μl DMSO，10 min振荡混匀，使结晶充分溶解。选择490 nm波长，以空白对照孔调零，在酶标仪上测定各孔光吸收度(A)值。抑制率=(对照孔A490－实验孔A490)/对照孔A490×100%。

1.3 统计学分析 统计数据均用x±s表示，采用 SPSS16.0软件处理，多组间单因素比较采用方差分析，应用最小显著差法(LSD)进行两两比较。

2 结果

2.1 各组药物血清作用于HSC不同时间对HSC增殖抑制率的影响比较 结果显示，药物血清干预24 h后，软肝片组与正常血清组相比更能抑制HSC体外生长(P＜0.05)，增殖抑制率为3.32%。抗纤方药物血清高、中、低剂量组干预HSC 24 h后与正常血清组相比，对其体外生长抑制作用均有显著性差异(P＜0.05)，增殖抑制率依次为15.65%，11.91%，7.62%。

药物血清干预48 h后与正常组相比，软肝片组、抗纤方高剂量组、中剂量组、低剂量组对HSC的体外生长抑制作用均有非常显著的差异(P＜0.05)，增殖抑制率依次为7.06%、18.27% ，13.64% ，9.01% 。

药物血清干预72 h后与正常血清组相比，软肝片组、抗纤方高剂量组、中剂量组、低剂量组对HSC的体外生长抑制作用均有非常显著的差异(P＜0.05)，增殖抑制率依次为10.20%、21.73%，15.19%，11.42%。抗纤方低剂量组与软肝片组比较，对HSC体外生长的抑制无显著性差异(P＞0.05)。可见，与正常血清组相比抗纤方药物血清对HSC的增殖有一定的量-效关系。见图1。

图1 HSC培养及加入药物血清后的HSC(×400)

2.2 各组药物血清对HSC作用不同时间490 nm波长OD值比较 正常大鼠血清干预HSC后，随着时间的延长，细胞的增殖呈增长趋势，HSC细胞活力旺盛，促进HSC的生长。见表1。

表1 各组药物血清对HSC作用不同时间的OD值(x±s)

3 讨论

HF的形成和发生是一个多因素相互促进、相互制约的结果。目前认为HSC在HF发生和发展过程中起着重要作用，也是目前研究HF发生机制中最受重视的细胞。肝细胞坏死能激活HSC并使之增殖〔7〕，HSC活化是HF最终的共同通路，是HF发生的细胞学基础。对于HF的治疗，目前尚无理想药物。已报道的秋水仙碱、青霉胺等十几种药物虽可抑制HF，但毒副作用较大，故临床上应用受到限制。近年来广泛开展了中药抗纤维化实验与临床研究，为临床治疗提供了许多经验。中医传统上的治则是活血化瘀、软坚消癥。本院韩涛副教授从“痰瘀互结”机制自拟“消痰化瘀抗纤方”，由瓦楞子、茵陈、当归、青皮等中药组成，其特点在于不仅活血化瘀，更为重要的是治痰。该方临床应用已有十余年，疗效较好，有效率为91%。本实验采用MTT比色法检测抗纤方药物血清对HSC生长增殖的影响，旨在从细胞分子生物学水平探讨抗纤方防治HF的作用机制，为中医药防治HF的临床研究提供实验依据。

结果表明，抗纤方药物血清可以显著抑制HSC增殖，与正常血清组比较有显著性差异，并呈现时效和量效关系;当抗纤方高剂量作用HSC 72 h时，抑制作用最为明显(增殖抑制率为21.73%)，与文献中的趋势相当〔8～10〕。加入正常大鼠血清培养的HSC，随着时间的延长OD值逐渐增加，且72 h组显著高于24 h组，提示在大鼠血清中含有可直接或间接促进HSC增殖的物质。单纯从OD值分析，抗纤方药物血清干预HSC后，随时间延长细胞增殖趋势上升，但是由于增殖抑制率是通过与对照组对比得出相对比值，正常血清组的OD值上升趋势更大，所以增殖抑制率总体上是上升的。因此，抗纤方药物血清可显著抑制HSC的体外增殖，当高剂量组作用72 h时，抑制作用最强，而且无明显的细胞毒性作用。

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5 马金霞，潘世扬，张 卫，等.MTT比色法用于肿瘤细胞体外药物敏感性试验的检测〔J〕.临床检验杂志，2002;20(2):104.

6 赵宏贤，陈 霞，李昌平，等.粉防己碱对大鼠肝星状细胞增殖及细胞周期的调控〔J〕.现代预防医学，2007;34(23):4437-9.

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