周利亘，王君虹，张治国，陈新峰，冯凤琴，刘相真

(1.浙江省农业科学院 食品科学研究所，浙江 杭州 310021;2.浙江大学 食品科学与营养系，浙江 杭州 310029;3.浙江省茶叶集团 茶叶研究所有限公司，浙江 杭州 310016)

蛋清蛋白含有丰富的蛋白质和人体所必需的多种氨基酸，且氨基酸组成配比均衡性好，是机体利用率最高的一种蛋白质。其营养成分和分子结构与人体血浆白蛋白十分相似，从而使其具有极强的营养和保健作用［1］。蛋清蛋白经过蛋白酶水解后，分子量降低，蛋白质的功能性质得到改善，溶解性提高，粘度、热凝固性降低，蛋白质的致敏性降低，更易于消化，并能产生抗氧化、降血脂、降血压等生理活性的小分子肽［2-4］。实验选用中性蛋白酶酶解蛋清蛋白粉制备蛋清蛋白肽，研究中性蛋白酶水解制备蛋清蛋白肽的工艺条件。

1 材料与方法

1.1 材料

蛋清粉，粗蛋白含量83.37%，购自大连绿雪蛋品发展有限公司。中性蛋白酶，购自南宁庞博生物工程有限公司。该酶由枯草芽孢杆菌1398发酵而来，酶活为80 000 U·g-1，最适酶解条件为50～55℃，pH值7.0～7.5。

使用的仪器设备有离心机、HH-4数显恒温水浴锅、pHS-3 C精密pH计等。

1.2 方法

配制5%蛋清粉溶液作为底物溶液，分别进行水解时间 (A)，底物 pH值 (B)，加酶量 (C)和水解温度 (D)的单因子试验和采用正交表L9(34)设计正交试验。按照试验设计调节底物溶液的pH值，在设定温度的水浴锅中温育10 min，加入设定量的酶进行酶解，酶解时间为所设计时间。水解过程中水浴控温、每30 min震荡混匀1次，并滴加浓氢氧化钠溶液使底物溶液的pH值维持在设定值。水解结束后，半微量凯氏定氮法测定总氮含量，计算氮回收率［5］。

氮回收率 (%)=所得上清液体积 (mL)×氮含量 (g·mL-1)/［底物体积 (mL)× 底物氮含量 (g·mL-1)］×100。

1.3 统计分析

单因子试验结果用Office EXCEL软件包作图。正交试验结果采用SPSS 16.0 GLM中单变量方差分析程序处理，P＜0.05视为差异显著。

2 结果与分析

2.1 水解时间

5%蛋清粉溶液，pH值6.5，温度为50℃，加酶量为4 000 U·g-1蛋清粉，分别水解不同时间。结果表明，随着水解时间的延长，氮回收率不断上升。但水解5 h后，氮回收率上升幅度很小(图1)。因此，确定5 h为较优水解时间。

2.2 底物p H值

5%蛋清粉溶液，温度为50℃，加酶量为4 000 U·g-1蛋清粉，分别在不同的pH条件下水解5 h。结果 (图2)表明，pH值为7.0～7.5范围内的氮回收率较高，pH值7.0时最高。因此，确定p H值7.0为最佳底物溶液pH值。

2.3 水解温度

图1 水解时间对氮回收率的影响

图2 底物溶液pH值对氮回收率的影响

5%蛋清粉溶液，pH值7，加酶量为4 000 U·g-1蛋清粉，分别在不同的温度条件下水解5 h。结果表明，在50～55℃范围内的氮回收率较高，温度为55℃时氮回收率最高 (图3)。因此，确定55℃为最佳水解温度。

图3 水解温度对氮回收率的影响

2.4 加酶量

5%蛋清粉溶液，温度为55℃，pH值7，分别添加不同量的酶，水解5 h。结果 (图4)表明，加酶量为5 000 U·g-1时氮回收率最高。

2.5 正交试验

图4 加酶量对氮回收率的影响

根据单因子试验结果，确定水解时间 (A)、底物溶液 pH值 (B)、加酶量 (C)和水解温度(D)的 1～3水平分别为 4，5，6 h;6.5，7.0，7.5;4 500，5 000，5 500 U·g-1;45，50，55℃。采用正交表L9(34)进行正交试验，试验统计分析结果见表1。

表1 各处理组合的氮回收率

极差分析及方差分析结果表明，各因素对氮回收率的影响大小依次为:D＞A＞C＞B，其中因素D对氮回收率的影响显著 (F=86.38，p＜0.05)。比较各因素的均值 (k1～k3)，确定中性蛋白酶水解蛋清粉的最优工艺条件为:A3B2C2D3，即底物溶液pH值为7.0、加酶量为5 000 U·g-1、水解温度为55℃，水解时间为6 h。验证试验证明了此结果，氮回收率为49.22%。

3 小结与讨论

通过单因子试验及正交试验，确定中性蛋白酶水解制备蛋清蛋白肽的最佳工艺条件为底物溶液pH值为 7.0，加酶量5 000 U·g-1，水解温度为55℃，水解6 h，氮回收率为49.22%。

预实验结果表明，5%的蛋清粉溶液稳定性较好。高于此浓度时，蛋清粉溶液易形成凝块;低于此浓度时，所得蛋清蛋白肽溶液含量偏低，不利于后期喷雾干燥［6］。此外，杜永盛考察了不同浓度的咸蛋清对蛋清蛋白氮回收率的影响，证实底物溶液的蛋白浓度为4.5%时，蛋清蛋白的氮回收率最高［1］。这一浓度与本研究蛋清粉溶液中蛋白浓度接近。

由正交试验结果可知，水解温度较高 (55℃)时，即使较短的水解时间 (4 h)也可获得较高的蛋白回收率，因此，可进一步研究水解温度与时间之间的关系，以获得最经济的酶水解工艺。此外，与碱性蛋白酶相比，中性蛋白酶对蛋清蛋白的降解效率不同［7］，可考虑进一步研究复合酶 (中性蛋白酶与碱性蛋白酶)水解蛋清蛋白的工艺，以获得最优化的工艺条件。

［1］ 杜永盛.酶解咸鸭蛋蛋清制取白蛋白肽的研究 ［D］.杭州:浙江大学，2006.

［2］ 杨万根.蛋清蛋白水解物的制备、结构及其生物活性的研究 ［D］.无锡:江南大学，2008.

［3］ Vioque J，Sánchez-Vioque R，Clemente A，et al.Partially hydrolyzed rapeseed protein isolates with improved functional properties ［J］.Journal of the American Oil Chemists'Society，2000，77(4):447-450.

［4］ 郑云.蛋清蛋白肽生产工艺的研究 ［D］.北京:北京化工大学，2006.

［5］ 迟玉杰，田波.蛋清寡肽制备技术的研究 ［J］.食品科学，2004，25(11):177-179.

［6］ 张治国，王君虹，陈新峰，等.酶解蛋清粉制备蛋清蛋白肽工艺条件研究 ［J］.浙江农业学报，2010，22(2):123-126.

［7］ 刘博群，林松毅，于志鹏，等.基于响应面法优化蛋清蛋白质降压肽的制备工艺 ［J］.食品科学，2009，30(16):172-176.