陈新峰，张治国，王君虹，周利亘

(浙江省农业科学院 食品科学研究所，浙江 杭州 310021)

胶原蛋白是人体内含量最多、分布最广泛的蛋白质，是一种与组织和器官功能密切相关的功能性蛋白。胶原蛋白的低免疫原性、生物相容性、生物降解性［1-3］和生物活性等特性，被愈来愈多的消费者所认识。胶原蛋白制品已被广泛应用于食品、保健食品、化妆品、医药等领域，市场需求急剧增加［4］。天然胶原蛋白经蛋白酶水解后，可得到具有抗氧化、降血压、降血脂、免疫调节、激素调节、抗疲劳等生理调节功能的小肽，是极具发展前景的功能因子，也是当前医药、食品界最热门的研究课题之一［5-6］。试验研究以畜产加工下脚料皮、骨等为原料，应用风味蛋白酶水解技术提取畜产胶原蛋白，采用正交试验优化酶解工艺参数。现将试验结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 原料、试剂和仪器

畜产胶原蛋白，实验室自制;95万U·g-1风味蛋白酶，上海海洋生物技术有限公司产品;21万U·g-1碱性蛋白酶、120万U·g-1木瓜蛋白酶、3.7万U·g-1菠萝蛋白酶、247万U·g-1中性蛋白酶、脂肪酶，南宁庞博生物工程有限公司产品;甲醛、氢氧化钠、浓硫酸，均为分析纯。

仪器设备有ALB-224电子天平，赛多利斯科学仪器有限公司产品;DK-8 D恒温水浴锅，上海精宏试验设备有限公司产品;PB-10型p H计，赛多利斯科学仪器有限公司产品。

1.2 制备和检测

1.2.1 畜产胶原蛋白溶液的制备

取畜产加工下脚料猪皮除去表面脂肪，破碎后加1倍水，搅拌均匀，30℃恒温水浴，加入NaOH调节pH值为9.0，加入0.1%的脂肪酶酶解30 min，85℃灭酶5 min，冷却后漂洗，然后进行组织捣碎，配成50%的畜产胶原蛋白液，待用。

1.2.2 畜产胶原蛋白的酶水解

将预处理的畜产胶原蛋白，配成蛋白含量为4%的溶液，升温至90℃，保持15 min预处理，调节到一定温度，并调节pH值，添加蛋白酶，恒温酶解，酶解过程中维持pH值稳定。酶解完毕后，100℃灭酶10 min，过滤，取上清液。

1.2.3 检测方法

所有样品均取样测定3次，取平均值。总氮含量按GB 5511—1985的方法测定，水解度采用游离氨基酸态氮甲醛快速滴定法［7］测定。

1.3 试验设计

1.3.1 蛋白酶的筛选

选用碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、菠萝蛋白酶、风味蛋白酶作供选酶，按照蛋白酶各自的适宜温度和p H值条件，酶解畜产胶原蛋白，测定不同蛋白酶酶解畜产胶原蛋白的水解度。通过比较各自的水解度，选择合适的蛋白酶。

1.3.2 风味蛋白酶单因素试验

［E/S］试验。在pH 7.0、50℃下，选取不同［E/S］条件，酶解5.0 h、分别测定水解度。

p H试验。在 ［E/S］1/10、温度 50℃条件下，选取不同的p H条件，酶解5.0 h，测定各自的水解度。

酶解时间试验。在 ［E/S］1/10、pH值什7.0、温度50℃条件下，选取不同的酶水解时间，测定各自的水解度。

酶解温度试验。在 ［E/S］1/10、pH值7.0条件下、选取不同的酶解温度，酶解5.0 h，测定各自的水解度。

1.3.3 风味蛋白酶正交试验

进行4因素正交试验，设 A因素为 ［E/S］值，B因素为pH值，C因素为酶解时间和D因素为酶解温度，采用L9(34)正交表进行工艺参数优化研究。

2 结果与分析

2.1 不同蛋白酶的效果

由图1看出，不同蛋白酶对畜产胶原蛋白的酶解效果各不相同，其中风味蛋白酶酶解水解度为14%，明显优于其它4种蛋白酶。因此，对风味蛋白酶进行进一步试验。

图1 不同蛋白酶水解度比较

2.2 单因素的效果

2.2.1 ［E/S］值

由图2看出，风味蛋白酶水解度随着 ［E/S］的升高而增大，当 ［E/S］值上升到1/10后，达到最高点，超过1/10后，水解度增加甚微，因此，选用 ［E/S］为1/10较为适宜。

图2 酶比底物 ［E/S］对水解度的影响

2.2.2 pH值

由图3看出，风味蛋白酶酶解畜产胶原蛋白的水解度从pH值为5时开始，随着pH值的上升而相应提高，当pH值为 7.0时达到最高点，pH值超过7.0后开始下降，表明中性条件对风味蛋白酶的酶解效果优于酸性和碱性条件，选用pH值 7.0较为适宜。

图3 pH对水解度的影响

2.2.3 时间

由图4看出，风味蛋白酶水解度随着酶解时间的延长而相应增加，当酶解时间达到5.0 h时，水解度达到最高，超过5.0 h后几乎保持不变，因此，酶解时间选用5.0 h较为适宜。

图4 酶解时间对水解度的影响

2.2.4 温度

由图5看出，风味蛋白酶酶解畜产胶原蛋白的水解度随着温度的上升而相应提高，50℃达最高点，超过50℃开始下降，酶解温度50℃较为适宜。

图5 酶解温度对水解度的影响

2.3 优化因素的效果

由表1看出，各试验因素对风味蛋白酶水解效果的影响［E/S］ ＞pH＞酶解温度＞酶解时间，其优化工艺参数为A3B2C2D2，即 ［E/S］3/25，酶解温度50℃，pH值 7.0，酶解时间5.0 h。将优化组合进行验证试验，其水解效果优于正交试验表中任1组合，水解度达到19.53%。

表1 风味蛋白酶酶解工艺的优化结果

3 小结

采用风味蛋白酶水解畜产胶原蛋白，其水解度明显优于其它4种试验用蛋白酶，且酶解液苦涩味低于其他4种蛋白酶水解液。试验研究表明，风味蛋白酶酶解畜产胶原蛋白的优化工艺参数为:［E/S］值3/25，酶解温度50℃，pH值7.0，酶解时间5.0 h;水解度可达到19.53%。

［1］ 石岗.生物活性肽进展 ［J］.北京农业科学，2002(3):9-13.

［2］ 陈国梁，贺翠莲.胶原蛋白的研究进展 ［J］.延安大学学报:自然科学版，2000，19(2):78-81.

［3］ 焦驼文，孔繁东，等.酶解蛋白制备抗氧化多肽的研究现状与展望 ［J］.中国酿造，2007(3):5-7.

［4］ 冯成利，党蕊叶，李校坤，等.猪皮胶原蛋白肽的提取及理化分析 ［J］.陕西师范大学学报:自然科学版，2007，35:20-23.

［5］ 曹荣安，李 浩，李良玉，等.胶原蛋白的生理功能特性及其应用 ［J］.肉制品加工与设备，2010(1):7-9.

［6］ 傅燕凤，沈月新.浅谈鱼皮胶原蛋白的利用 ［J］.食品研究与开发，2004，25(2):16-18.

［7］ 何照范，张迪清.保健食品化学及其检测技术 ［M］.北京:中国轻工业出版社，1997.