刘彦红,刘红燕,张立会*,田雪红,聂建国

(1.吉林大学白求恩第一医院,吉林长春130021;2.吉林大学第二医院;3.内蒙古根河市满归中心卫生院)

1 材料及方法

1.1 标本采集

均取自吉林大学第二医院妇科,卵巢浆液性囊腺癌(CA组)(IIIc期)与卵巢浆液性囊腺瘤(BE组)的组织标本各6例。已告知患者取组织学标本用途,并同意取材。标本病理资料由吉林大学第二医院病理科证实。手术标本均在30分钟内置于-80℃低温冰箱内保存。

1.2 蛋白样品制备

将融化的标本置于无菌培养皿中,用磷酸盐缓冲液进行冲洗,去除黏附的血红蛋白和其他蛋白。然后把标本切成1 mm3大小,置入液氮中,研磨粉碎。然后用裂解液进行溶解,裂解液成分包括7M尿素,2 M硫脲,2%CHAPS,50 mM Tris,和50 mM DTT,1 mM PMSF and 1 μ g/ml蛋白酶抑制剂。同时加入DNA酶与R NA酶去除DNA和RNA。然后在100 000 g条件下离心1小时去除不溶解成分。所有样品用Bradford方法测定蛋白浓度后置-80℃保存。

1.3 蛋白质酶切

酶切前所有样品用25 mM NH4HCO3稀释使尿素浓度低于2 M。酶切时首先用20 mM DTT在56℃条件下还原1小时,再在常温下避光用50 mM碘乙酰胺烷基化30分钟,然后按1∶50比例加入测序级胰酶37℃酶切过夜。酶切后样品真空抽干后-80℃保存备用。

1.4 二维液质联用分析

所有样品用缓冲液A(0.1%甲酸)溶解后,应用二维液质联用进行分析,每次实验上样量为50μ g。强阳离子柱为150 mm×0.32 mm,反相柱为150 mm×0.17 mm,强阳离子柱的乙酸氨洗脱方法为12.5 mM,25mM,50 mM,75 mM,250 mM和5 M。反相柱洗脱方法为5%-30%缓冲液B(0.1%甲酸,99.9%乙腈,流速为2 μ l/min),洗脱时间为 3小时。每个样品做两次实验。经反相色谱洗脱的多肽应用LTQ XL质谱仪进行检测,m/z检测范围为400～2 000 amu,应用数据依赖方式进行次二级质谱扫描(每次全扫描后做10次二级扫描,母离子m/z宽度为3 amu,35%标准碰撞能量,动态排除时间为1.5 min)。……