李桂荣,周鸿雁,张文松*

(1.吉林大学第二医院眼科医院,吉林长春130041;2.吉林大学中日联谊医院眼科)

近年来,热休克蛋白(heat shock protein,HSPs)对细胞的保护作用以及在细胞凋亡的调节方面受到了广泛的关注。但在晶状体中的研究较少。我们利用RT-PCR方法观察了HSPs的两种类型:HSP70和HSP27基因在老年性白内障和正常人晶状体上皮细胞中的表达情况,以探讨这两个基因与老年性白内障发生的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验组为北京朝阳医院2005年老年性白内障患者晶状体的前囊膜,共42眼(男26眼,女16眼)均为不同年龄的老年性白内障,平均年龄63.4岁±8.2岁,实验的对照组为健康成年眼球晶状体的前囊膜,共15例,为青壮年。

1.1.2 主要试剂 RNA提取试剂盒、RT-PCR试剂盒、dNTPs(10 mM)、Taq 酶(2 U/μ l)、β-Actin(25 pmol/μ l)。均为北京鼎国生物技术有限公司的产品。

1.1.3 引物 从PUBMED/Nucleotide GenBank中查出人HSP70、HSP27基因全序列,β-actin序列作为内参照。应用Primer Premier 5.0设计引物。

引物由北京奥科生物公司合成。序列如下:HSP70 上 游 引 物 :5′-GTACAGAAAGACATTAAAAAT-3′,下 游 引 物 :5′-TCAGGGTCGAATAAAGTTACT-3′。扩增产物长度为 200 bp。HSP27上游引物:5′-GCGAATTCCCTGCTAAAAATACCCGACT-3′;下 游引 物 :5′-GCAGCTGGATGCCCACCCCTGC-3′。扩增产物长度为 295 bp。 β-actin 上 游 引 物:5′-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3′;下 游 引 物:5′-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3′。扩增产物长度为506 bp。

1.2 方法

提取两组晶状体前囊膜中总RNA,并以此逆转录成cDNA。

以β-actin作为内参,将其与待测得目的基因同时扩增,分两管相同体系进行。按PCR试剂盒说明书操作。

琼脂糖电泳分别取两管反应管中5 μ l扩增产物和上样缓冲液0.3 μ l点样后90 V电泳1 h,凝胶用紫外凝胶成像系统观察,并进行半定量分析。图像分析仪测照片上扩增产物的平均灰度,计算出其基因表达量与其对应的内参β-actin表达量的比值。

1.3 统计学处理

应用SPSS11.0软件包进行统计分析,各组两两比较采用方差分析,取P＜0.05为显著性差异。……