张舵舵,赵燕颖,张 妍,刘 玲,高振平*

(1.吉林大学基础医学院,吉林长春130021;2.吉林大学中日联谊医院;3.吉林大学第四临床医院;4.延边大学医学部)

胶质瘤是颅内最常见的肿瘤,大多数胶质瘤恶性程度高,侵袭性强,手术不易完全切除,术后复发率高,病人预后不良。p53蛋白具调节细胞生长和诱导凋亡的作用,MDM2作为一个癌基因主要是抑制野生型p53的激活转录功能和抗肿瘤活性。研究发现MDM2蛋白的过度表达导致同时表达的p53蛋白量减少导致肿瘤的发生[1]。研究报道MDM2癌基因在肉瘤、膀胱癌、胶质瘤、肺癌等都有过度表达[2]。本研究体外合成特异性针对MDM2基因的siRNA,研究siRNA对MDM2基因的阻抑作用和对人胶质瘤细胞的生长增殖抑制作用,为胶质瘤的基因治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料

SilencerTM siRNA construction kit(Ambion公司);LipofectamineTM 2000转染试剂盒(Invitrogen);胎牛血清、IMDM 培养基(Gibco公司);MTT、RT-PCR kit(Promega)、引物由上海生工生物技术公司合成;U251细胞株(中国科学院上海细胞所)。

1.2 siRNA的设计和合成

根据已知Genebank中MDM2mRNA序列和siRNA的设计原则[4],利用Ambion公司的在线设计来寻找靶序列,并做同源序列搜索,排除那些和其他编码序列或EST同源的序列,用silencerTM siRNA construction kit体外合成si-MDM2-1,si-MDM2-2,阴性对照control siRNA购于Ambion,与任何编码序列无同源性。

1.3 细胞培养 人胶质瘤细胞株U251细胞IMDM培养液(10%胎牛血清,青霉素100 μ g/ml,链霉素100 μ g/ml)中,37℃、5%CO2孵箱内培养。常规更换培养液、消化传代,实验所用细胞均处于对数生长期。

1.4 细胞转染 对数生长期细胞在无抗生素的培养基中培养细胞融合率达80%-95%时开始转染。操作按LipofectamineTM 2000试剂说明书进行。分四组转染:空白对照组(只加转染试剂),转染阴性对照质粒和转染两个siMDM2质粒组,瞬时转染后提取细胞RNA以备后续实验用。……