单广夷，孔垂泽，李军，张哲，陈启光

（中国医科大学附属第一医院泌尿外科，沈阳 110001）

膀胱癌是泌尿外科常见的恶性肿瘤，手术切除是其常规治疗方法，但手术对于晚期肿瘤效果不良，所以药物辅助治疗被寄予厚望。雷帕霉素（rapamycin，RAPA），又名西罗莫司（sirolimus），分子式C51H79NO13，分子量 914 200。它具有免疫抑制作用［1］，同时还能够抑制血管平滑肌增殖，可通过阻止平滑肌细胞增生和迁移而减少再狭窄。近年来的研究证明，雷帕霉素可以抑制如肝癌、胰腺癌、膀胱癌等［2~4］多种肿瘤的生长，具有抑制肿瘤细胞增殖［5］、诱导细胞凋亡［6］、抑制侵袭［7］、抑制肿瘤血管生成［8］等多种作用。其肿瘤抑制作用的主要靶点为哺乳类动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）［9］。本研究为揭示雷帕霉素对膀胱癌的作用，探讨了雷帕霉素对膀胱癌T24细胞系增殖及侵袭的影响，并初步判断mTOR是否在T24细胞中存在表达，旨在进一步探明雷帕霉素对膀胱肿瘤影响的可能通路。

1 材料与方法

1.1 试剂及仪器

雷帕霉素（美国LC公司）；膀胱癌T24细胞系（中国科学院细胞库）；MTT（美国Sigma公司）；transwell板（美国 Corning公司）；matrigel基底膜胶（美国BD公司）；酶标仪（国产）；倒置显微镜（Olympus，日本）；RPMI 1640培养基（Gibical公司）；胎牛血清（天津市灏洋生物制品科技有限责任公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及干预：T24细胞置于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的RPMI-1640培养液中，37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养。雷帕霉素溶于无水乙醇，－20℃保存，使用时用RPMI 1640稀释至需要浓度。将细胞随机分为：（1）处理组：接种细胞进入对数生长期后，按不同检测项目加入雷帕霉素；（2）对照组：不加入雷帕霉素。每天换液。

1.2.2 肿瘤细胞生长抑制率检测：采用MTT比色法。T24细胞经胰酶消化后，接种于96孔板，每孔加100μL细胞悬液（含105个细胞），贴壁培养24 h后，再加入100μL培养液，使雷帕霉素终浓度为10~1 000 nmol/L，每孔设4个复孔并设对照孔（加细胞不加药物）和凋零孔（加培养液不加细胞），培养24 h、48 h和 72 h后，每孔加 MTT（5 mg/mL）20 μL，再培养4 h，弃培养液。每孔加DMSO 150μL，避光振荡混匀，结晶溶解后用酶标仪测波长490 nm的吸光度值（OD 值）。肿瘤细胞生长抑制率（IR）=（1－实验孔OD值/对照孔OD值）×100%。

1.2.3 体外侵袭实验：将matrigel用RPMI-1640培养液按1︰5比例稀释后，每孔35μL均匀地铺在聚碳酸酯膜上（24孔板，8μm孔径），37℃孵育4 h。待成胶后，消化细胞，用含5%FBS的RPMI 1640培养液悬浮，每孔加入200μl密度为4×105/mL的细胞悬液，并在小室内加入雷帕霉素，调终浓度至50~200 nmol/L。聚碳酸酯膜下层加入600μL含10%FBS的RPMI 1640培养液，培养24 h。将膜用PBS洗2次，甲醇固定15 min，洗2次，加入结晶紫（0.1%）染色，室温30 min，PBS洗2次，擦去matrigel胶。随机选取5个视野观察，计数每个视野的细胞数，取平均数，重复3次。侵袭抑制率=（1－实验组穿膜细胞平均数/对照组穿膜细胞平均数）×100%。

1.3 统计学分析

全部数据以x±s表示，应用SPSS13.0软件进行单因素方差分析。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 细胞生长抑制率

不同浓度的雷帕霉素作用T24细胞24 h、48 h、72 h后，随着药物浓度的增高和时间的延长，对T24细胞的生长有明显的抑制作用，且呈时间和浓度依赖性，当1 000 nmol/L雷帕霉素作用72 h时，生长抑制率达（54.28±2.42）%，IC50为 199.53 nmol/L，各时间组与浓度组之间比较差异具有统计学意义（P ＜ 0.05），见表 1，图 1。

表1 雷帕霉素干预T24后细胞生长抑制率（%，x±s）Tab.1 The inhibition rate of rapamycin on T24 cells（%，x±s）

图1 MTT法检测雷帕霉素干预对T24细胞的生长抑制作用Fig.1 Inhibitory effect of rapamycin on the growth of T24 cells assessed by MTT assay

2.2 细胞侵袭能力

小室侵袭实验表明，雷帕霉素处理组的细胞数低于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05），且随着雷帕霉素浓度的升高，T24细胞的侵袭能力下降（P＜0.05），提示雷帕霉素抑制了肿瘤细胞的侵袭能力。与对照组相比，200 nmol/L组浸润细胞数下降了31.8%。见表2，图2。

3 讨论

膀胱癌的治疗方法主要为手术、膀胱灌注、化疗、放疗等。现有的膀胱灌注及全身化疗药物，虽有一定效果，但毒副作用较大，因此临床急需一种毒副作用较小、且有一定治疗效果的新药。雷帕霉素是mTOR的特异性抑制药物，具有抑制肿瘤生长，减少肿瘤淋巴管形成，抑制肿瘤血管内皮生长等多种抗肿瘤作用。mTOR为一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，属于PIKK（Ptdlns3K-related kinase family）家族成员之一［10］，可协调蛋白质的生物合成和降解。本研究通过检测雷帕霉素对膀胱癌T24细胞的作用，间接证明了mTOR在T24细胞中的存在。

表2 雷帕霉素对T24细胞侵袭能力的影响Tab.2 Effect of Rapamycin on T24 cell invasion

图2 雷帕霉素干预后穿膜细胞情况 ×200Fig.2 Transwell chamber assay results of T24 cells×200

肿瘤的恶性程度体现在肿瘤细胞的增殖、分化、侵袭和转移的能力。增殖是肿瘤细胞的基本特性，当细胞因为突变而丧失对分裂的调控时，就会成倍增殖形成肿瘤，抑制肿瘤细胞的增殖是抗肿瘤药物的基本要求。本研究中，MTT结果显示，雷帕霉素对T24细胞具有明显的增殖抑制作用，且呈现量效－时效的关系，即随着雷帕霉素浓度的升高和作用时间的延长，T24细胞生长抑制率逐渐升高。侵袭是指肿瘤细胞穿过血管壁，克隆增殖的过程。抑制肿瘤的侵袭能力也是控制肿瘤转移的一种途径。本研究通过transwell的方法检测了雷帕霉素对膀胱癌T24细胞侵袭能力的影响。在药物浓度的选择上，通过IC50计算及分析，最终确定选择对细胞生存影响较小的50~200 nmol/L浓度区间进行侵袭实验，并选择24 h的侵袭时间，以防止细胞穿膜后的增殖影响实验结果。研究结果显示，雷帕霉素能够抑制T24细胞的侵袭，处理组与对照组相比，穿过基质膜的细胞数量明显减少，且抑制作用呈剂量依赖性。

综上所述，雷帕霉素是一种很有潜力的抗肿瘤药物，通过对其通路的深入研究，有望寻找到更加容易调控的靶点，这将是未来进一步深入研究的重点。

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