李文媛，王 莹，李明秋，佟晓杰

（1．牡丹江医学院解剖教研室，黑龙江牡丹江 157011;2．中国医科大学解剖教研室，沈阳 110001）

血管生成是指由原已存在的毛细血管通过出芽或内填形成新的毛细血管，促进血管生成被认为是治疗缺血性脑损伤富有前景的新策略。血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是一种高度特异的促内皮细胞生长因子，与VEGF受体结合能促进缺血性脑损伤后血管再生及侧支循环的形成，在血管生成中起关键作用［1，2］。黄芪皂苷Ⅳ是一种纯化小分子皂苷（分子质量为784），作为黄芪的主要活性成分［3］，已被广泛的应用于缺血性脑血管病的治疗。但黄芪皂苷Ⅳ对脑缺血/再灌注损伤中血管生成的影响尚不明确。该研究通过建立大鼠大脑中动脉缺血模型，探讨黄芪皂苷Ⅳ对脑缺血损伤血管生成的作用机制，为黄芪皂苷Ⅳ治疗脑缺血损伤提供新的实验依据和理论依据。

1 材料与方法

1．1 动物 雄性 SD大鼠42只，清洁级，体质量280～320 g，购于中国医科大学实验动物中心（许可证号:SYXK［辽］2003-0013）。

1．2 药品和试剂 黄芪皂苷Ⅳ（西安赛邦医药），纯度98%。尼莫地平注射液（河北医科大学制药厂），兔抗大鼠VEGF抗体、兔抗大鼠CD34抗体、免疫组化SP试剂盒、DAB显色试剂盒购于北京中山生物试剂公司桥生物公司，抗β-actin抗体购于Santa Cruz公司。

1．3 动物分组 大鼠按体质量分层，随机分为4组:假手术组（n=6）、模型组（n=12）、尼莫地平对照组（n=12）、黄芪皂苷Ⅳ组（n=12）。

1．4 造模 参照Longa等［4］的线栓改良法复制大鼠左侧大脑中动脉缺血局灶性脑缺血模型，大鼠用10%水合氯醛（250 mg/kg）麻醉后，分离左侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉和翼腭动脉。分离过程中电凝血管小分支以防出血，结扎翼腭动脉，然后在距颈总动脉分叉1 cm处结扎颈外动脉，并于距结扎处近端约0．5 cm处远心端用电凝器灼断之。动脉夹夹闭左颈总动脉，在颈外动脉剪一切口，将一长5 cm，直径0．26 mm的尼龙线经左侧颈外动脉主干切口缓慢向颈内动脉入颅方向推进，以颈总动脉分叉处为标记，推进18～20 mm感到轻微阻力时，即阻断大脑中动脉。阻断2 h后，拔出尼龙线，扎紧动脉残端，缝合皮下组织和皮肤，完成脑缺血/再灌注损伤模型。假手术组除不插线外，全过程同其他各组。各组于缺血前5 min，缺血后12、24 h给药，腹腔注射。黄芪皂苷Ⅳ给药剂量为20 mg/kg，尼莫地平注射液给药剂量为1 mg/kg，均为临床等效剂量。假手术组和模型组给予等体积生理盐水。术后当日给大鼠饮水，次日开始自由饮食。

1．5 检测指标

1．5．1 神经行为学评估 动物缺血2 h拔线栓后，按Zea Longa方法［5］进行神经功能缺损评分:0分，无任何神经功能缺失;1分，左前肢不能伸展;2分，向左侧行走;3分，向左侧转圈成追尾状;4分，意识障碍，无自主行走。评分在1～3分之间视为造模成功，否则弃之不用。保证各组每个时间点的动物数目。由一位不了解分组情况的观察者在灌流后72 h评估记录神经行为学评分。

1．5．2 免疫组织化学检测 以水合氯醛麻醉动物，打开胸腔，暴露心脏，于右心耳处剪一小口，同时将一输液针头插入左心室，向主动脉方向灌入37℃左右的生理盐水，直至右心房流出清亮液体，再由左心室灌入4%多聚甲醛磷酸缓冲液约100 mL固定。断头取出脑组织，分离出左侧缺血大脑半球，4%多聚甲醛再固定4～6 h，20%和30%的蔗糖梯度脱水，OCT（optimuMcutting temperature）包埋剂包埋，置－70℃冰箱保存。实验时取出行冰冻切片，在视交叉后1～4 mm处冠状切面切开，在海马齿状平面连续冠状切片，片厚4μm。组织薄片以磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）0．01 mol/L 漂洗 2次，0．5%过氧化氢孵育10 min;PBS漂洗3次，正常山羊血清37℃孵育15 min后，滴加稀释后的一抗VEGF（1∶100）、CD34（1∶100），4℃过夜。滴加生物素标记体，30 min，37℃。滴加过氧化物-链霉素卵白素37℃，30 min。3，3-二氨基联苯胺四盐酸盐显色液显色。苏木精复染，以PBS代替一抗作阴性对照。镜下观察并摄片。阳性率的定量分析:每个标本取4张切片，400倍光镜下每张切片在海马CA1区随机选5个视野，用计算机图像分析系统（HPIAS-1000）对各组阳性细胞进行吸光度（absorbance，A）分析。

1．5．3 CD34阳性判断及微血管密度（microvascular density，MVD）计数标准 CD34主要表达在血管内皮细胞胞质，胞质染成黄棕色者为阳性，未被染成黄棕色者为阴性。采用Weidner等［5］制订的方法即确定组织孤立的棕黄色血管内皮细胞或细胞簇代表一条单独的微血管，在10倍物镜下挑选微血管分布最高的区域，然后在200倍视野下（0．723 mm2/视野）计数5个视野中被CD34染成棕黄色的血管数目，取其平均值作为MVD。分辨不清或染色模糊的细胞不计入计数结果。

1．5．4 免疫蛋白印迹检测 检测VEGF表达提取蛋白后采用二辛可宁酸法定量试剂盒测定蛋白浓度。十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白后转至硝酸纤维素膜;封闭缓冲液封闭后，加入一抗（1∶100稀释）4℃孵育过夜，二抗（1∶2000稀释）孵育2 h，TBS洗净后经显色液显示15 min，扫描后经Image J图像分析软件对印迹区进行灰度分析。

1．6 统计学方法 所得数据采用SPSS 13．0软件进行统计分析，数据以均数±标准差（±s）表示，采用方差分析F检验，多个样本均数的两两比较采用q检验。P＜0．05为差异具有统计学意义。

2 结果

2．1 神经功能评分 假手术组神经功能损害评分值为0，无神经功能损害。黄芪皂苷Ⅳ组神经功能损害评分低于模型组评分（q=4．65，P ＜0．05）和尼莫地平组评分（q=3．11，P＜0．05），差异有统计学意义（表1）。

表1 各组动物缺血/再灌注72 h后海马VEGF蛋白和MVD表达（±s）

表1 各组动物缺血/再灌注72 h后海马VEGF蛋白和MVD表达（±s）

注:VEGF，血管内皮细胞生长因子;MVD，微血管密度

组别 神经功能评分 VEGF吸光度值 MVD（个/400倍视野）32．37 ±2．48模型组 3．62±0．65 8．92±4．74 35．69±2．87尼莫地平对照组 2．71±0．32 11．26 ±3．67 36．43±3．45黄芪皂苷Ⅳ组 1．49±0．21 17．83 ±5．19 44．41±3．59 F假手术组00＜0．05 ＜0．05 ＜0．05 27．796 36．427 21．193 P

2．2 免疫组织化学染色 VEGF蛋白阳性表达位于细胞质和细胞膜，呈棕黄色颗粒（图1），阴性细胞的细胞质不着色。假手术组海马CA1区中未见VEGF蛋白表达，模型组VEGF蛋白表达较假手术组显著增加（q=4．07，P ＜0．05），黄芪皂苷Ⅳ组 VEGF 蛋白表达较模型组（q=3．91，P＜0．05）和尼莫地平对照组（q=3．57，P ＜0．05）显著增高，两组比较差异具有统计学意义（表1）。

图1 缺血/再灌注后海马免疫组化染色

2．3 MVD检测 CD34标记后将微血管内皮细胞的细胞质染色呈棕黄色，阴性细胞的细胞质不着色。CD34标记微血管呈棕色管腔（图1）。模型组MVD较假手术组显著增加（q=3．77，P ＜0．05），黄芪皂苷Ⅳ组 VEGF蛋白表达较模型组（q=5．11，P ＜0．05）和尼莫地平对照组（q=4．63，P ＜0．05）显著增高，两组比较差异具有统计学意义（P＜0．05）（表1）。

2．4 Western blot检测 假手术组未见VEGF蛋白表达，模型组VEGF蛋白相对表达较假手术组显著增加（q=3．44，P ＜0．05），黄芪皂苷Ⅳ组 VEGF 蛋白相对表达较模型组 （q=3．61，P＜0．05）和尼莫地平对照组（q=3．63，P ＜0．05）显著增高，两组比较差异具有统计学意义（P＜0．05）（图2）。

图2 W estern blot检测各组VEGF蛋白表达（n=4）

3 讨论

脑卒中是导致患者死亡的主要原因。其中45．5%～75．9%为脑梗死［6］，寻找对脑梗死有疗效的药物，降低脑血管病的发病率和病死率是目前国内外学者共同关心的课题。海马对脑缺血最为敏感，即使短暂的脑缺血也可造成锥体细胞延迟性神经元死亡。所以，海马成为缺血性脑损伤研究的一个典型脑区。

VEGF是一种高度特异的促内皮细胞生长因子。有研究表明［7］，在缺血性脑损伤半暗带低氧区，激活的低氧诱导因子1α诱导VEGF和其受体过量表达，VEGF与其受体结合后，可促使新血管生成，改善局部血供，并保护内皮细胞不发生程序性死亡，从而减轻缺血性脑损伤［8］。Zhang等［9］的研究显示，在缺血大鼠脑表面注入人工重组VEGF165能明显加强缺血性脑损伤后的血管再生，减轻卒中恢复过程中的神经功能障碍。本实验显示脑缺血/再灌后72 h后VEGF蛋白表达和MVD较假手术组显著增加（P＜0．05），提示脑缺血后可诱导VEGF生成，进而促进血管生成，这与以往的研究结果相一致［8］。Jerzy 等［10］认为，脑缺血损伤后MVD增加与患者生存时间呈正相关，因此如何在缺血性脑损伤早期诱导VEGF大量表达，增加新生血管生成为缺血性脑损伤患者的治疗提供了线索。

黄芪是一种被广泛应用于治疗缺血性脑血管病的传统中药，具有补气升阳、利水退肿的功效。黄芪皂苷Ⅳ是黄芪的主要活性成分。有研究显示黄芪皂苷Ⅳ［11，12］具有降压，调节机体免疫功能，抗炎症，镇静镇痛，神经保护，降低病毒活性等多种药理作用。该实验中，黄芪皂苷Ⅳ组的神经功能恢复明显优于尼莫地平对照组和模型组，提示黄芪皂苷Ⅳ具有神经保护作用，这为黄芪皂苷Ⅳ治疗缺血性脑损伤提供了行为学上的实验依据。尽管黄芪皂苷Ⅳ在脑缺血损伤条件下能够发挥多种作用，但在脑缺血损伤时黄芪皂苷Ⅳ对VEGF和血管生成的影响尚不明确。该实验结果显示，黄芪皂苷Ⅳ组大鼠海马CA1区VEGF蛋白表达和MVD均明显高于模型组和尼莫地平对照组（P＜0．05）。提示在脑缺血/再灌注损伤时，黄芪皂苷Ⅳ能够上调VEGF蛋白的表达，从而促进新生血管生成，这可能是黄芪皂苷Ⅳ对脑缺血/再灌注损伤起保护作用的分子机制之一。

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