马 腾，王 萍，薛一雪

(中国医科大学基础医学院神经生物学教研室，沈阳110001)

研究显示，化疗药物进入脑胶质瘤组织必须通过血肿瘤屏障(BTB)，BTB在很大程度上影响其化疗效果［1］;肿瘤组织的化疗药物浓度提高2倍，其疗效增加10倍，增加脑胶质瘤组织中的化疗药物浓度是提高其疗效的重要因素。国内外研究表明，小剂量缓激肽(BK)及其受体激动剂RMP-7能增加BTB通透性，两者的作用及机制基本相似。目前，对BK及其受体激动剂增加BTB通透性的机制仍不明确。研究证明［2］，BK可降低脑微血管内皮细胞(RBMECs)膜上的紧密连接相关蛋白occludin表达，通过开放紧密连接(TJ)的细胞旁途径开放BTB，但其具体机制不明。RhoA/ROCK 信号通路参与许多血管活性物质介导的内皮细胞通透性升高过程［3］。以往研究证明，ROCK参与BK介导的BTB通透性增加［4］。为探讨RhoA参与BK对occludin分布和表达的调节作用，2009年3月～2010年3月，我们进行了相关研究。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料及试剂 Nuserum血清(BD Biosciences);FBS(Hyclone公司);occludin抗体(Zymed);RhoA特异性抑制剂肉毒梭菌C3胞外酶、DMEM培养液、BK(Sigma)。

1.2 实验方法

1.2.1 RBMECs原代培养和体外BTB建模 将48只3～5 d的胚胎大鼠用CO2吸入法处死，开颅取其大脑皮质。分离培养大鼠RBMECs及体外BTB建模方法参考文献［2，5］。将大鼠分为6组各8只，即对照组、BK 0 min组(A 组)、BK 5 min组(B 组)、BK 10 min组(C组)、BK 15 min组(D组)和BK 15 min+C3胞外酶组(E组)。对照组加等量无菌生理盐水1 μmol/L 处理 15 min;A、B、C、D 组分别在不同时间加BK处理;E组将C3胞外酶50 μg/ml加入Transwell上室中，4 h后移去上室培养基，向上室加BK 1 μmol/L 作用15 min。

1.2.2 跨内皮细胞电阻抗(TEER)检测 应用Millicell-ERS电阻测量系统，检测各组体外 BTB的TEER。

1.2.3 Western-blot法检测occludin表达 当Transwell上室的细胞生长到融合时，先用PBS冲洗，再用细胞铲刮取下，倒入裂解液A 1 ml中，匀浆、离心，上清液为蛋白样品液。……