任海林，孙 岩，李世斌，韩瑞发

(天津医科大学第二医院天津市泌尿外科研究所，天津300211)

miR－17－5p 和 miR－20a 是 mir－17－92 基因簇产物，通过转录后基因沉默效应调控多种抑癌基因或癌基因的表达，在不同的肿瘤中起抑癌基因或癌基因的作用。E2F3属于转录因子E2F家族，在膀胱癌中有扩增和过表达［1］，E2F3有很强的促进 mir－17－92 基因簇启动子活性作用，并诱导 mir－17－92 基因簇表达［2，3］。我们期望通过研究 E2F3、miR－17－5p和miR－20a在膀胱癌组织中的表达情况，阐明E2F3、miR－17－5p 和 miR－20a 之间是否存在相关性。

1 材料与方法

1.1 材料 膀胱组织标本选用我院2009年10月～2010年2月行膀胱全切或部分切除术的20例膀胱组织，并经术后病理证实为膀胱移行细胞癌，新鲜组织获得后立即放置于－80℃超低温冰箱。患者术前均未行放疗、化疗与免疫治疗。其中男16例、女4例，年龄43～81岁、平均58.15岁。组织病理分级按照WHO(1973年)分级标准，其中G1级10例，G2级4例，G3级6例。另取10例开放前列腺摘除术患者的正常膀胱黏膜组织作为对照。膀胱移行细胞癌细胞系5637、T24购自中国医学科学院基础医学研究所，在含10%小牛血清RPMI－1640培养基，37℃、5%CO2条件下培养。总RNA提取试剂盒购自申能博彩生物科技有限公司;cDNAD第一链合成试剂盒购自 QIAGEN 公司;E2F3、miR－17－5p、miR－20a荧光探针和内参GAPDH、U6荧光探针，2×PCR TaqMan®Universal PCR，TaqMan®MicroRNA Reverse Transcription ki均购自 ABI公司;鼠抗人E2F3和GAPDH抗体购自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 基因的表达检测 取冻存组织和膀胱移行细胞癌细胞系5637、T24，放于DEPC处理的1.5 ml EP管中。加组织裂解液后，应用超声细胞粉碎机粉碎组织，按试剂盒说明提取总RNA。按cDNAD第一链合成试剂盒说明用提取的总RNA逆转录合成第一链cDNAD，按2×PCR TaqMan®Universal PCR说明，以第一链cDNAD为模板、E2F3和GAPDH荧光探针为引物扩增，反应条件:95℃变性10 min，95℃复性15 s，60 ℃延长 1 min，共40 个循环;按 TaqMan®MicroRNA Reverse Transcription kit操作手册说明，以提取的总 RNA 为模板，用 miR－17－5p、miR－20a 和 U6 逆转录引物(5×TaqMan®Gene Expression Assay Mix)逆转录合成 miR－17－5p、miR－20a 和 U6 第一链，反应条件:16℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃延长5 min;然后按2×PCR TaqMan®Universal PCR试剂盒说明，以miR－17－5p、miR－20a 和 U6 第一链为模板，用 miR－17－5p、miR－20a和U6荧光探针(10 ×TaqMan®Gene Expression Assay Mix)为引物扩增;以上荧光PCR检测均在7900HT型荧光定量PCR仪(ABI公司)操作完成，检测方法为相对定量分析2－ΔΔCt法，每个样品每次试验至少设立3个重复，重复3次试验。

1.2.2 检测E2F3蛋白变化 取不同病理分级组织、正常黏膜对照组织适量，加组织裂解液后超声细胞粉碎机粉碎组织，13 000 g离心3～5 min，取上清液。用SDS－PAGE电泳(5%层积胶，12%分离胶)，电转移至硝酸纤维素膜，用含5%脱脂奶粉的TBS封闭过夜，一抗于4℃孵育4 h，TBS洗涤3次×5 min;辣根过氧化物酶标记的二抗于室温孵育2 h，TBS洗涤3次×5 min，膜与化学发光底物孵育5～10 min，经X线片曝光、显影、定影。用凝胶成像分析软件BandScan 5.0进行灰度分析。

1.2.3 统计学方法 采用SPSS11.5软件对数据进行统计处理，所得数据均以±s表示，3组样本以上计量资料用方差分析，多样本均数间的多重比较用Dunnett－t检验。以P≤0.05为有统计学差异。

2 结果

各组 E2F3、miR－17－5p 及 miR－20a 表达水平比较见表1。

表1 E2F3、miR-17-5p 及 miR-20 相对定量(2－ΔΔCt)分析结果(¯x ±s)

3 讨论

E2F3参与调控细胞周期与DNA复制，可以促进循环细胞的 G1/S 期转换［4］。Feber等［1］检测了TCCSUP、5637和HT1376 3种膀胱癌细胞系，发现在这3种细胞系中E2F3的mRNA过表达，均有高水平的E2F3蛋白质生成。本试验也发现膀胱癌组织E2F3的mRNA和蛋白相对正常膀胱组织都呈高表达状态，E2F3蛋白有随着病理分级的升高而升高的趋势。综上所述，可以推断E2F3是一种能促发膀胱癌的癌基因。

本研究发现，在膀胱癌细胞系中，高分化的5637较低分化的T24高表达E2F3蛋白，这与癌组织是正好相反的，这与Feber等［1］的研究是一致的，这一现象说明不同来源的组织和细胞其基因的表达和调控是不同的，也充分说明了基因调控的复杂性。miRNA在基因组上的分布是成簇的，同一基因簇内的miRNA作为一个整体，通过一个共同的启动子被转录，然后经过一系列转录后加工形成不同的单体miRNA［5］。mir－17－92 是 miRNA 家族中一组多顺反子簇，包含了 7 个成熟的 miRNA:miR－17－5p、miR－17－3p、miR－18、miR－19a、miR－20a、miR－19b－1 和 miR－92－1［6］。已有研究认为，E2F3 有很强的诱导 mir－17－92基因簇表达、并促进 mir－17－92基因簇启动子活性作用［3］，研究同时也证实，mir－17－92 基因簇产物miR－17－5p 和 miRNA－20a 可以调节 E2F3 的蛋白表达［7］。这样 mir－17－92、E2F3 就形成了一个调控网络。以 mir－17－92 和 E2F1、E2F2、E2F3 为核心的反馈调控环路已在淋巴瘤、前列腺癌、宫颈癌［8］等肿瘤中证实。本研究发现 miR－17－5p和 miR－20a相对正常膀胱组织都呈高表达状态，miR－20a有随着病理分级的升高而降低的的趋势，miR－17－5p、miR－20a的表达与E2F3的增高有某种程度的相关性。E2F3是促发膀胱癌的癌基因，miRNA是一类负调控其他蛋白质编码基因的基因，在不同的肿瘤中起抑癌基因或是癌基因的作用，由此推断:癌基因E2F3高表达诱导并促进 mir－17－92基因簇转录，其产物 miR－17－5p、miR－20a抑制 E2F3蛋白表达的进一步升高，使E2F3的表达维持在适当的范围，miR－17－5p 和miR－20a在膀胱癌中可能是一种肿瘤抑制因子。

综上所述，E2F3、miR－17－5p、miR－20a 是否在膀胱癌中构成调控环路，尚需进一步研究证实。对E2F3与mir－17－92基因簇之间的调控环路的研究可能为膀胱癌发病机制研究和膀胱癌生物治疗带来重大突破，同时可为膀胱肿瘤提供一个全新的肿瘤标记物，对膀胱癌的诊断和预测将有重要临床价值。

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