吕 栋，崔培林，徐有青，杨昭徐

(首都医科大学附属北京天坛医院，北京100050)

创伤性脑损伤(TBI)作为一种严重的应激源，也可以引起肠黏膜屏障损伤［1，2］，但其发病机制的研究目前还较少。研究发现，在肠黏膜炎症过程中诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达和活性及其产物一氧化氮(NO)的含量明显增加，并与炎症程度有关［3］。本研究通过观察TBI后肠黏膜屏障损伤时iNOS表达的变化探讨其在肠黏膜屏障损伤时可能的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 12周龄健康雄性Wistar大鼠48只，体质量200～250 g，由中国科学院遗传与发育生物学研究所动物中心提供。实验前于北京市神经外科研究所动物室，在恒温、恒湿、12 h光照/黑暗交替条件下，给予啮齿类动物标准饮食进行饲养。

1.2 试剂与仪器 二胺氧化酶(DAO)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所，鲎试剂盒及内毒素标准品购自上海伊华临床医学科技公司，组织裂解液购自碧云天公司，30%丙烯酰胺贮液、四甲基乙二胺、10%的十二烷基硫酸钠购自北京化学试剂公司、Western Blotting Luminol Reagent化学发光试剂盒、兔iNOS单克隆抗体、PVDF膜购自Sant Cruz公司，辣根过氧化物酶标记的抗兔二抗购自北京中杉金桥公司。307－2B牙科台式电钻、鼠立体定位仪、自由落体致颅脑损伤装置、低温组织匀浆机、高速台式冷冻离心机、ECL化学发光成像系统、荧光分光光度仪由北京市神经外科研究所提供。

1.3 方法

1.3.1 TBI模型的制备及分组 采用自由落体撞击法建立TBI模型［4］。48只大鼠，随机数字法平均分为2组，A组为假手术组(对照组);B组为TBI组。对照组动物只开骨窗不行自由落体撞击。2组动物分别在手术后3、6、12、24 h点处死，取脑组织和距回盲部5 cm处回肠5 cm，进行相关指标检测。

1.3.2 细胞形态学观察 动物处死后，取脑组织和末端回肠组织用10%甲醛固定后进行普通光镜检查。

1.3.3 肠黏膜通透性测定 动物处死后，门静脉取血测血清中内毒素浓度及DAO的活性，同时取末端回肠组织，低温下快速制成组织匀浆，3 000 r/min，离心10 min后取上清液备用，按试剂盒说明书严格操作，测定肠黏膜组织中DAO活性。

1.3.4 iNOS蛋白检测 取冻存的新鲜肠黏膜组织200 mg，在液氮预冷的研钵中研碎，加入组织裂解液，冰上放置20 min，13 000 r/min低温下离心15 min，取上请，用Bradford法进行蛋白定量分装，放入－80℃冰箱保存。免疫蛋白印迹法测定总蛋白中iNOS含量。

1.3.5 统计学方法 采用SPSS13.0软件对数据进行统计学处理，数据用表示，同组不同时间计量资料采用方差分析，组间计量资料比较采用t检验。以P≤0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 组织学改变

2.1.1 脑组织形态学改变 TBI组蛛网膜下腔增宽并有灶性出血，脑组织结构疏松，神经元固缩、变性、部分缺失，胶原细胞增生，纤维母细胞增生、机化，小血管增生，管壁机化，少量淋巴细胞浸润。对照组脑组织仅见少量炎性细胞浸润，余基本正常。

2.1.2 肠黏膜组织细胞形态学改变 光镜下，TBI组3 h黏膜出现损伤，绒毛水肿，局部有缺损;6 h肠绒毛肿胀、缩短、增粗，顶端部分破损或断裂，破损处有淋巴细胞浸润;12 h黏膜明显损伤，出现局灶性糜烂、坏死，绒毛断裂或相互融合，淋巴管扩张，有炎性细胞浸润;24 h损伤进一步加重，上皮细胞变性、坏死，黏膜有坏死脱落区域。

2.2 检测指标变化

2.2.1 内毒素和DAO的变化 TBI组3 h时血中内毒素已经升高，随时间增加升高幅度逐渐增大，在观察期限内24 h最为明显(P＜0.01)。肠黏膜组织DAO，TBI组3 h活性已经开始下降，随时间增加下降程度逐渐加重，在24 h最为明显(P＜0.01);而血清中DAO活性的变化刚好相反，见表1。

表1 各组大鼠门静脉血内毒素水平及DAO含量变化(EU/ml±s)

表1 各组大鼠门静脉血内毒素水平及DAO含量变化(EU/ml±s)

注:与对照组比较，*P＜0.05，△P ＜0.01

组别 内毒素(E U/m l)肠黏膜组织D A O(U/m g)血清D A O(U/m g)对照组3 h 0.1 0 5±0.0 0 6 0.9 2±0.0 8 1.2 1±0.2 8 6 h 0.1 0 3±0.0 1 6 0.9 4±0.1 2 1.2 6±0.4 3 1 2 h 0.1 1 2±0.0 1 6 0.9 0±0.1 1 1.2 5±0.3 1 2 4 h 0.1 1 4±0.0 2 1 0.9 6±0.0 9 1.1 8±0.2 5 T B I组3 h 0.2 8 9±0.0 1 7* 0.6 3±0.1 3* 3.0 3±0.3 3*6 h 0.3 7 8±0.0 2 1△ 0.4 7±0.0 7△ 3.5 6±0.5 9△1 2 h 0.4 7 7±0.0 2 6△ 0.3 9±0.0 8△ 3.7 9±0.4 5△2 4 h 0.4 7 9±0.0 1 9△ 0.3 1±0.0 7△ 4.5 1±0.5 7△

2.2.2 肠黏膜组织中iNOS蛋白变化 与对照组比较，TBI组3 h iNOS蛋白表达已经开始增加(P＜0.05)，然后随时间延长表达逐渐增加，12 h为最高(P＜0.01)，而后逐渐降低，见图1。

图1 肠黏膜组织中iNOS蛋白表达的电泳结果

3 讨论

本实验采用自由落体撞击法成功建立了TBI的动物模型，形态学证实肠黏膜结构受到损伤。DAO和内毒素是反映小肠黏膜屏障结构和功能的理想指标，本实验中，小肠黏膜组织中DAO活性明显降低，而血清中的DAO活性则明显升高，提示肠黏膜屏障受损，DAO被大量释放入血。同样TBI组各时间点血中内毒素水平也明显升高，提示内毒素、细菌和大分子物质穿越受损的肠黏膜而发生移位。DAO、内毒素的变化均反映了肠黏膜的通透性增加，肠黏膜屏障功能受到了损伤。

NO是由左旋精氨酸和分子氧在NOS的催化下生成的。一定量的内源性NO是维持肠黏膜正常结构所必需的［5］。它可以扩张肠道微血管，调节肠道血流，减轻缺血/再灌注损伤，维持肠黏膜完整性，有效地阻止肠道菌群移位。大量的NO能直接损伤细胞的DNA;可以作用于线粒体，阻断电子传递链，抑制细胞内呼吸，致细胞缺氧和细胞内自由基增加［6］;可以刺激单核巨噬细胞系统释放细胞因子即内毒素，诱导细胞凋亡或对靶细胞产生直接损伤作用，因此有明显的细胞毒作用［7］。iNOS主要存在于巨噬细胞、肝细胞、软骨细胞，它们的表达是钙非依赖型的。只有当机体内出现致炎因子或内毒素时，或是机体处于低氧甚至休克状态时iNOS才大量表达，合成大量的NO［8］，它的表达需要多种物质的诱导。在哺乳动物的胃肠道组织中存在NOS的广泛表达，它们主要分布在胃肠的黏膜层、黏膜下层、肌层、浆膜层以及壁内神经丛，黏膜下层小动脉细胞及平滑肌细胞中也有NOS分布。这一特点提示在各种原因导致的肠黏膜损伤的机制中，有可能也涉及到iNOS高表达引起的NO大量产生［9］。本实验采用免疫印迹方法方法检测了肠黏膜组织中iNOS的表达情况，结果发现，在TBI后3 h，肠黏膜组织中的iNOS的蛋白表达开始增加，随后逐渐升高，12 h达到高峰后逐渐降低。这一结果与肠黏膜屏障损伤程度的变化相一致，说明了TBI后肠黏膜组织中的iNOS被诱导激活，表达增加，从而产生大量NO，参与了TBI后肠黏膜屏障的损伤。

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