侯冬枝，梁晓晖，赵世洪，刘长科，平其能，刘军（1.广东药学院，广州市 510006；.中国药科大学，南京市 10009；.南京医科大学第二附属医院，南京市 10011）

脂质体作为蛋白质、多肽类药物载体，可避免其过早被生物酶降解，增加药物的稳定性，国内、外学者已将其广泛应用到如胰岛素、白细胞介素等生物活性大分子药物的研究中[1，2]。笔者利用逆相蒸发法将牛血清白蛋白（BSA）包封于脂质体中，以增加其稳定性。为检测该脂质体的包封率，笔者将葡聚糖凝胶DEAE-Sephadex A50微柱离心与双波长考马斯亮蓝法/酶标仪法结合，建立了可以用于BSA脂质体包封率测定中对痕量蛋白质检测的方法，所需样品量仅为100 μL，一次即可进行较大量样本的检测，且操作快速、简单、重复性好。

1 仪器与试药

1.1 仪器

BS214D电子分析天平（德国赛多利斯公司）；RE-52A旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器）；循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸公司）；550酶标仪（美国Bio-Rad公司）。

1.2 试药

BSA脂质体（批号：20061022，BSA含量：800 ng·mL－1）和空白脂质体（批号：20061011）均由中国药科大学药剂学平其能教授实验室自制；大豆磷脂（以下简称磷脂，上海太伟药业有限公司，注射级）；考马斯亮蓝（美国Amresco公司，G-250型）；BSA（南京生兴科技有限公司，含量：≥98%）；葡聚糖凝胶DEAE-Sephadex A50（美国Pharmcia公司）；胆固醇、95%乙醇、浓磷酸、乙醚、正己烷等均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 空白脂质体和BSA脂质体的制备

采用逆相蒸发法制备空白脂质体和BSA脂质体。具体如下：称取处方量磷脂、胆固醇和吐温-80置于茄形瓶中，加入适量混合溶剂（乙醚-正己烷＝10∶1），待膜材溶解后，滤膜过滤，注射器注入BSA水溶液适量，短时超声使成乳液后，置于0℃冰水浴减压旋转蒸发，至胶态后，再继续旋转蒸发，直至得到BSA脂质体混悬液。最终制得样品中的BSA含量为800 ng·mL－1。

空白脂质体制备方法同上，只缺少注入BSA水溶液的步骤。

2.2 染料的制备

将100 mg考马斯亮蓝溶解在50 mL 95%乙醇中，再加入100 mL的浓磷酸（85%，W/V），最后加蒸馏水至1000 mL，过滤，冷藏避光保存。

2.3 双波长考马斯亮蓝法/酶标仪法含量测定方法的建立

2.3.1 BSA样品液与染料体积比的确定。在洁净小离心管中精密加入以纯净水溶解制备的BSA样品液，使其浓度分别为0.25、0.5、1、2、4、8、16、32 μg·mL－1，再加入“2.2”项下制备的染料，使样品与染料体积比分别为1∶1、1∶3、1∶4，轻轻振摇均匀，取出200 μL置于酶标板中，反应10 min后，以595、450 nm作为检测波长测定吸光度，以A595/A450值对BSA浓度（c）进行线性回归，得回归方程的相关系数分别为0.9856、0.9992、0.9980，表明BSA样品液与染料体积比为1∶3时，线性相关性较好，因此本试验中选择样品液与染料体积比为1∶3。

2.3.2 反应时间的确定。在洁净小离心管中精密加入4 μg·mL－1BSA溶液100 μL，再加入300 μL染料，轻轻振摇，取200 μL置于酶标板中，以595、450 nm作为检测波长，分别于反应2.5、5、10、20、30、40、50、60 min后测定吸光度，计算A595/A450。测定结果见图1。

图1 吸光度值-反应时间曲线Fig 1 Absorbance-reaction time curves

图1结果表明，反应时间在10 min以前，BSA与染料未反应完全，30 min以后，体系不稳定，明显褪色，因此反应时间应控制在10～30 min之间，本研究将反应时间选定为10 min。

2.3.3 测定方法的确定。根据上述试验，最终确定的测定方法为：在离心管中精密加入100 μL待测样品，再加入300 μL染料，轻轻振摇，取200 μL置于酶标板中，以595、450 nm作为检测波长，反应10 min后测定吸光度。

2.3.4 标准曲线的绘制。制备0.25、0.5、1、2、4、8、16、32 μg·mL－1系列浓度待测样品，按照“2.3.3”项下方法进行操作，以A595/A450值对BSA浓度（c）进行线性回归，得标准曲线方程为：A595/A450＝0.1168c+0.7791（r＝0.9992）。结果表明BSA检测浓度线性范围为0.25～32 μg·mL－1。

2.3.5 方法回收率考察。在离心管中分别精密加入0.25、4、32 μg·mL－1的待测样品各4份，按照“2.3.3”项下方法进行操作，计算回收率，结果平均回收率为99.56%，RSD＝1.52%，表明方法回收率良好，详见表1。

表1 回收率试验结果Tab 1 Results of recovery tests

2.3.6 方法精密度试验。在离心管中分别精密加入0.25、4、32 μg·mL－1的待测样品各4份，按精密度试验方法操作并计算，结果各浓度组RSD分别为2.73%、0.95%、1.62%。

2.4 BSA脂质体包封率的测定

2.4.1 DEAE-Sephadex A50微柱离心法。（1）凝胶的活化处理。称取少许DEAE-Sephadex A50颗粒于水中浸泡，并在搅拌下加入0.0175 mol·L－1、pH6.3 磷酸盐缓冲液1000 mL，室温放置过夜，第2天用同一缓冲液洗3～4次，倾出上层较小颗粒后，进行装柱、平衡。（2）微柱离心分离步骤。于自制的微型离心柱中加入上述活化处理后的DEAE-Sephadex A50至5 mL体积处，将此柱置于塑料离心管中，1500 r·min－1离心3 min除水，准备上样。精密吸取0.2 mL BSA脂质体混悬液上柱，500 r·min－1离心5 min。加水0.3 mL，1500 r·min－1离心8 min，收集离心液。

2.4.2 DEAE-Sephadex A50微柱离心法柱系统的考察。（1）微柱对空白脂质体的回收率。为考察自制微柱对脂质体是否有吸附，以空白脂质体进行下述试验：微柱离心除去水分，精密吸取0.2 mL空白脂质体，上柱4份，按照“2.3.5”项下方法操作，收集离心液；另取0.2 mL空白脂质体4份，加水0.3 mL；分别将离心液及空白脂质体置于10 mL容量瓶中，用混合溶剂（乙醚-异丙醇-水＝1∶2∶2）定容至刻度，于267 nm波长下测定吸光度。按照下式计算微柱对空白脂质体的回收率：回收率（%）＝A离心液/A脂质体×100%（A离心液为上柱离心处理后得到液体的吸光度值，A脂质体为空白脂质体的吸光度值）。结果，平均回收率为97.78%（RSD＝0.18%）。（2）微柱分离效率。将微柱离心除水，精密量取5 μg·mL－1BSA溶液0.8 mL，加入0.2 mL空白脂质体成为混合液。从中精密吸取0.2 mL上柱（n＝4），以下按照“2.4.1”项中“微柱离心分离步骤”项下方法操作，收集离心液；另从混合液中精密吸取0.2 mL，加水0.3 mL，混合后作为混悬液，分别在滤液和混悬液中加10%乳化剂辛基酚聚氧乙烯醚（OP）0.5 mL振摇，按照“2.3.3”项下方法操作，计算A595/A450，代入回归方程计算离心液及混悬液中BSA的浓度c离心液、c混悬液，根据柱分离效率（%）＝[1－（c离心液/c混悬液）]×100%计算，得其值大于90%，说明柱分离效率较好。

2.4.3 BSA脂质体包封率测定。（1）脂质体混悬液中的BSA的含量测定。精密加入0.2 mL BSA脂质体混悬液于5 mL容量瓶中，依次加入0.3 mL水、10%乳化剂OP 0.5 mL振摇，按照“2.3.3”项下方法操作，计算A595/A450，代入回归方程计算混悬液中BSA的含量为c总。（2）脂质体中包载的BSA量测定。收集“2.4.1”项中“微柱离心分离步骤”项下获得离心液，加入乳化剂OP 0.5 mL，按照“2.3.3”项下方法操作，计算A595/A450，代入回归方程计算脂质体中包载BSA的含量c包封。参照文献[3～6]中公式计算BSA脂质体包封率分别为（31.32±0.67）%、（34.68±0.62）%、（32.75±0.83）%，平均值为32.91%（n＝3）。

3 讨论

在酸性条件下，考马斯亮蓝染料呈红色，当其与蛋白质结合时变成蓝色，因此考马斯亮蓝染料和考马斯亮蓝-蛋白质结合物有不同的吸光系数。传统考马斯亮蓝法利用考马斯亮蓝-蛋白结合物最大吸收波长595 nm时的吸光度值来反映蛋白质的浓度，而忽略了游离考马斯亮蓝染料在此波长下也有一定的吸光度。因此，本试验利用双波长法来消除杂质吸收的影响从而提高分析的准确度[7，8]。

酶标仪可一次检测大量标本，所需样品量少，并能减少系统误差，因此本试验是在原有实验[7]的基础上运用酶标仪代替紫外-可见分光光度计进行的，以进一步提高检测灵敏度、降低实验误差。

本文中采用层析法将BSA脂质体与未包封的游离药物分离开，经过前期的试验研究[7]，发现采用交联度较高的DEAE-Sephadex A50凝胶可以更加有效地将脂质体与BSA分离。试验中将自制的BSA脂质体装入自制凝胶微柱中，可以实现游离蛋白质与脂质体快速、有效的分离，方法简单易行，相对于普通凝胶层析柱分离法对样品的稀释倍率大大降低，适用于测定痕量大分子蛋白质脂质体的包封率，且还可以用于其他痕量蛋白质的测定。

在此次BSA脂质体包封率测定试验中，0.2 mL样品在经过了微柱的分离稀释、添加破乳剂及酶标仪测定时添加染料等诸多稀释步骤后，其中蛋白质的浓度降至0.3 μg·mL－1左右，接近此方法的检测浓度下限0.25 μg·mL－1，此乃本方法不足之处，今后试验还需探索灵敏度更高的检测方法和手段。

[1]Ye Q，Asherman J，Stevenson M，et al.Depofoam technology，a vehicle for controlled delivery of protein and peptide drugs[J].J Control Release，2000，64（1）：155.

[2]侯冬枝，谢长生，黄寿吾.用注射法和复乳法制备低分子肝素脂质纳米粒[J].中国医院药学杂志，2004，24（11）：672.

[3]Hou DZ，Xie CS，Huang KJ，et al.The production and characteristics of solid lipid nanoparticles（SLNs）[J].Biomaterials，2003，24（5）：1781.

[4]侯冬枝，平其能，谢长生，等.雷公藤内酯醇新型固体脂质纳米粒（SLN）微观结构研究[J].药学学报，2007，42（4）：23.

[5]侯冬枝，谢长生，平其能，等.雷公藤内酯醇新型SLN载体的制备[J].中国药学杂志，2007，42（12）：33.

[6]侯冬枝，谢长生.米非司酮固体脂质纳米粒的性状研究[J].中国医药工业杂志，2004，42（10）：545.

[7]侯冬枝，刘长科，平其能，等.牛血清白蛋白脂质体包封率的测定方法研究[J].药学学报，2007，42（6）：2.

[8]陈鸿琪，李宝惠.定量测定与蛋白质的新进展[J].理化检验-化学分册，2000，36（2）：91.