钱爱东，王 建，王春芳

(吉林农业大学动物科技学院，吉林 长春 130118)

牛结核病(Bovine tuberculosis)主要由牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)引起的一种人兽共患传染病[1]。目前，牛结核病的防治主要采用牛结核菌素试验(PPD)进行变态反应检疫，对检出的阳性牛进行隔离或捕杀。然而，当感染副结核分枝杆菌等环境中的分枝杆菌时容易出现假阳性反应，并且不能辨别患病牛和BCG免疫牛[2-3]。应用该防治措施不能有效地控制牛结核病，反而使该病近年来呈上升趋势[4]。

研究证实，在M.bovisrecA基因中存在内蛋白插入位点。在recA-a位点存在一个1320 bp的内蛋白编码基因，该内蛋白只存在于M.bovis和结核分枝杆菌中，在其他分枝杆菌中均不存在，应用该内蛋白诊断结核病不受其他分枝杆菌的干扰[5-8]。IS6110是结核分枝杆菌复合体(MTBC)中共有的插入序列，其大小为1361 bp，为功能性转座子[9]。IS1081在MTBC中有6个拷贝[10]。因此，本研究以M.bovis recA、IS6110和IS1081为对象建立三重PCR反应，为研究新型诊断方法奠定基础。

1 材料和方法

1.1 菌株M.bovisValleeⅢ株购自中国兽药监察所；人结核临床分离株为长春市结核病医院惠赠；副结核分枝杆菌、草分枝杆菌、猪大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、牛葡萄球菌和猪链球菌均为本实验室保存。

1.2 主要试剂 TaqDNA聚合酶、核酸分子量标准DL2000和dNTPs均购自TaKaRa公司；DNA凝胶回收纯化试剂盒购自杭州维特洁生化技术有限公司。

1.3 染色体DNA的提取 将M.bovisValleeⅢ接种于改良的罗氏培养基中培养。7周后按文献[11]方法提取染色体DNA。

1.4 引物的设计与合成 根据GenBank中登录的recA(BX248343)、IS6110(X57835)和 IS1081(X61270)基因序列，设计3对扩增引物，序列为：recA-P1(1965-1982)：5'-CGGATCACGGAATAGCGG-3'；recAP2(1117-1134)： 5'-GATGGCAGGGATGGTTGG-3'；IS6110-P1(3126-3143)：5'-TACGGTGCCCGCAAAGT G-3'； IS6110-P2(3633-3652)： 5'-TTGATCGTCTCGG CTAGTGC-3'； IS1081-P1(1268-1287)： 5'-ATCGGGT ACTCGACGCTCTG-3'；IS1081-P2(1597-1615)： 5'-G GGTGTTGGTGGTTTGCTG-3'；引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.5 recA、IS6110和 IS1081基因的 PCR扩增以M.bovisValleeⅢ染色体DNA为模板，分别扩增recA、IS6110和IS1081基因。反应条件为：98℃8 min，96℃ 1 min、54℃ (53.5℃、54℃)1 min、72℃1.5 min，30个循环；72℃10 min。PCR产物进行1.0%的琼脂糖凝胶电泳分析。

1.6 recA、IS6110和IS1081基因PCR产物的纯化及序列分析 PCR扩增产物经DNA凝胶回收纯化试剂盒进行纯化，由上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序，应用BLAST进行序列分析。

1.7 recA-IS6110-IS1081三重PCR反应的建立以M.bovisValleeⅢ染色体DNA为模板，在同一PCR反应中加入引物recA-P1和recA-P2、IS6110-P1和IS6110-P2以及IS1081-P1和IS1081-P2，建立recAIS6110-IS1081三重PCR反应。PCR反应体系(总体积为 25 μL)为：10×Buffer 2.5 μL，recA-P1、recAP2、IS6110-P1、IS6110-P2、IS1081-P1、IS1081-P2(25 pmol/μL)各 0.3 μL，dNTPs(10 mmol/μL)3 μL，TaqDNA 聚合酶 1.5 μL(5 u/μL)。PCR 反应条件为：98℃8 min；96℃1 min、53.5℃ 1 min、72℃1.5 min，35个循环；72℃ 10 min。反应结束后，取PCR产物进行1.0%的琼脂糖凝胶电泳分析。

1.8 敏感性试验和特异性试验 测定模板DNA浓度，将所提取的DNA依次做10倍梯度稀释，用引物P1和P2进行PCR扩增。均进行5次以上的扩增反应。用副结核分枝杆菌、草分枝杆菌、人结核临床分离株、猪大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、牛葡萄球菌和猪链球菌的基因组DNA进行PCR扩增，每次扩增反应同时设阴性对照和以M.bovisDNA为模板的阳性对照。

2 结果与讨论

2.1 recA、IS6110和IS1081基因的PCR扩增及序列分析 以M.bovis染色体DNA为模板，分别对recA、IS6110和IS1081基因进行PCR扩增，产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳分析，可见大小约860 bp、520 bp和340 bp的DNA片段。测序结果表明，所扩增的recA、IS6110和IS1081基因大小分别为866bp、527 bp和348 bp。BLAST分析结果显示所获得的recA、IS6110和IS1081基因与 GenBank中登录M.bovisAF2122/97recA、IS6110和IS1081基因的同源性均达到99%。

2.2 recA-IS6110-IS1081三重PCR反应的建立以M.bovisValleeⅢ染色体DNA为模板，在同一PCR反应中同时加入3个基因的引物进行三重PCR扩增。扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳分析，可见3个DNA片段，与预期的DNA片段大小相符(图 1)。

2.3 PCR扩增的敏感性和特异性 通过DNA分光光度法测定模板DNA浓度为390 μg/mL，将基因组DNA梯度稀释，进行敏感性试验。结果表明，recA、IS6110和IS1081基因PCR扩增的敏感性分别达到585 fg、19.5 fg和19.5 fg(图2～图4)。特异性试验结果表明，该PCR反应只能扩增出M.bovis和人结核临床分离株，其他扩增反应结果均为阴性(图5)。

图1 recA-IS6110-IS1081基因三重PCR扩增Fig.1 Amplification of recA,IS6110 and IS1081 by triple PCR

图2 recA基因敏感性试验Fig.2 Sensitivity test of recAgene by PCR detection

图3 IS6110基因敏感性试验Fig.3 Sensitivity test of IS6110 gene by PCR detection

图4 IS1081基因敏感性试验Fig.4 Sensitivity test of IS1081 gene by PCR detection

本研究以M.bovis染色体DNA为模板，以3个特异性引物扩增recA、IS6110和IS1081基因，并建立了M.bovis三重PCR检测方法。为进一步研究M.bovis recA、IS6110和IS1081基因作为新型诊断试剂奠定了基础。

2008年，谢芝勋等建立了鉴别M.bovis和结核分枝杆菌的双重PCR快速检测方法，检测的敏感性达到50 pg[12]。2010年，谢志勤等根据结核分枝杆菌23SrRNA基因序列和M.bovis特殊基因序列建立了结核分枝杆菌和M.bovis双重实时荧光PCR检测方法，结果可检测到10 copies模板的M.bovis和结核分枝杆菌[13]。本研究所建立的recA-IS6110-IS1081三重PCR反应，经敏感性和特异性试验验证，可做为M.bovis和结核分枝杆菌的快速检测和流行病学调查工具。

图5 特异性试验Fig.5 Specificity tests of recA,IS6110,and IS1081 gene by PCR detection

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