彭 凌，朱必凤，杨旭夫，刘博婷，韦昭玉

(韶关学院英东生命科学学院，广东 韶关 512005)

副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis，HPS)能够导致病猪发生以纤维素性多发性浆膜炎、心包炎、关节炎为特征的综合征，又称为革拉瑟氏病(Glasser's disease)。该病于1910年由Glasser首次报道。目前，国际上将HPS菌株分为15个血清型。研究表明，不同血清型菌株之间的交叉免疫保护力不强，或者无交叉保护作用，而且约15%～41%的分离株不能够以现有的血清分型方法进行鉴定，给免疫防治造成很大困难[1-3]。

对于HPS的研究除血清分型外还常采用酶切指纹图谱(REF)、多位点酶电泳分析(MLEE)和肠杆菌科基因间重复一致序列PCR(Enterobacterial repetitive intergenic consensus-PCR，ERIC-PCR)等方法进行HPS基因的分型。但前两种方法耗时、操作复杂，并且成本高。2000年Rafiee等将ERIC-PCR用于HPS分型中，显示不同血清型的标准菌株具有不同的指纹图谱，具有良好的多态性，该技术可以用于该菌感染的流行病学研究，有利于鉴定主要流行菌株及其进化关系[4]。

外膜蛋白(OMP)是革兰氏阴性细菌的表型标志，菌株不同，则OMP型不同；在血清学分型复杂的情况下，OMP是用于追踪流行株的工具[5]。OMP分型仅涉及OMP的提取和SDS-PAGE分析，具有快速、低消耗的特点，如果把OMP分析应用于HPS的分型可以在一定程度上辅助ERIC-PCR分型的准确性。

本实验在对HPS分离鉴定的基础上，对不能定型的野外分离株采用ERIC-PCR分型和OMP分型技术研究不同猪场的HPS流行复杂程度及差异，并应用于HPS感染的流行病学调查。

1 材料和方法

1.1 菌株24个HPS分离株为本实验室按照文献[6]方法由3个发病猪场发病猪的上呼吸道或病变组织中分离并鉴定，分别为江西(J猪场)J1～J88个分离株；广东(G猪场)G1～G99个分离株；上海(S猪场)S1～S77个分离株；HPS标准菌株H555株、胸膜肺炎放线杆菌(A.pleuropneumoniae)S3-4株、支气管败血波氏杆菌(B.bronchiseptica)X362株、金黄色葡萄球菌(S.aureus)ATCC25923株和大肠埃希氏菌(E.coli)ATCC25922株均由本实验室保存。

1.2 PCR鉴定 参照文献[7]合成引物：HP1F3：5'-TATCGGGAGATGAAAGAC-3'、HP2F2：5'-GTAAT GTCTAAGGACTAG-3'和 HRex：5'-CCTCGCGGCTT CGTC-3'，预扩增片段大小为1090 bp。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。采用冻融法提取细菌DNA。

PCR 反应体系为：10×Buffer 2.5 μL、MgCl21.5 μL、引物 HP1F31 uL、引物 HP2F21 μL、引物HRex 1 μL、模板 DNA 3 μL、4×dNTPs 0.4 μL、TaqDNA聚合酶0.4 μL、无菌去离子水14.2 μL。反应条件为：94℃ 3 min；94℃ 1 min、56℃ 45 s、72℃ 1 min，35个循环；72℃8 min。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，利用Master VDS凝胶成像系统进行照相。

1.3 ERIC-PCR分型 按照文献[4]报道的引物序列(ERIC-1R：5'-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3'和 ERIC-2R：5'-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3')，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。采用酚氯仿法抽提细菌DNA[8]，并进行PCR扩增，反应体系(25 μL)为：10 mmol/L Tris-HCl(pH8.3)、10 mmol/L KCl、2.5 mmol/L MgCl2、0.4 mmol/L dNTP、引物各100 ng、基因组DNA 100 ng、TaqDNA聚合酶1.5 U。扩增程序为：94℃2 min；94℃30 s、50℃ 30 s、72℃ 6 min， 35个循环； 72℃ 6 min。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，并利用Master VDS凝胶成像系统照相。

1.4 OMP的SDS-PAGE检测 OMP的提取参照文献[9]方法进行，并采用不连续SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色观察结果。

2 结果

2.1 PCR鉴定 对24个HPS分离株的PCR鉴定结果表明，24个分离株和阳性对照均能够扩增出预期的1090 bp的条带，而阴性对照、A.pleuropneumoniae、B.bronchiseptica、S.aureus和 E.coli均未扩增出特定条带(图1)。

2.2 ERIC-PCR指纹图谱 对24个HPS分离株进行ERIC-PCR扩增，得到具有高重复性、清晰的电泳图谱。结果表明：PCR产物大小约为500 bp～3000 bp之间，表现出良好的DNA多态性，各分离株均扩增3条～7条带，最大约3000bp，最小约500bp(图2)。各分离株间指纹图谱表现出一定程度的相同或差异。根据每个分离株扩增产物中分子量不同的DNA条带的差异，24株分离株可以直观分为10种指纹图谱。图谱Ⅰ包含5个分离株：J1、J3、J4、J5和J8；图谱Ⅱ包含3个分离株：J2、J6和J7；图谱Ⅲ为1株G1；图谱Ⅳ包含7株：G2、G3、G4、G6、G7、G8和G9；图谱Ⅴ仅1个分离株G5；图谱Ⅵ包含2个分离株：S1和S4；图谱Ⅶ为1个分离株S2；图谱Ⅷ为1个分离株S3；图谱Ⅸ包含2个分离株：S5和S6；图谱Ⅹ为1个分离株S7。J猪场存在图谱Ⅰ和Ⅱ包含的8个HPS分离株；G猪场存在图谱Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ包含的9个HPS分离株；S猪场存在图谱Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ和Ⅹ包含的7个HPS分离株。表明同一猪场流行多种基因型，并且不同猪场流行基因型不同。

2.3 OMP图谱 提取24个HPS分离株的OMP进行SDS-PAGE电泳分析，结果显示：每个分离株存在8条或8条以上蛋白条带，分子量为17 ku～120 ku之间，主要位于30 ku～43 ku之间，每个分离株在36.6 ku～38.5 ku之间均存在一条蛋白量较大的条带。表明各猪场流行的菌株及其流行的复杂程度存在差异。根据每个分离株OMP的分子量大小和浓度的差异，24株分离株可直观分为10种OMP图谱(图3)，该结果与ERIC-PCR分析结果一致。

为验证OMP的重复性，本研究对分离株进行4次重复试验，结果显示同一分离株产生的OMP图谱相同，具有较好的重复性。

图1 HPS分离株PCR扩增结果Fig.1 Identification of H.parasuisisolates by PCR

图2 24株HPS分离株ERIC指纹图谱Fig.2 ERIC-PCR fingerprints(Ⅰ-Ⅹ)of 24H.parasuisisolates

图3 24株HPS的外膜蛋白图谱Fig.3 OMP patterns(Ⅰ-Ⅹ)of 24H.parasuisisolates

3 讨论

为确定江西、广东、上海3个发病猪场HPS病的流行情况，本研究对由发病猪群分离鉴定的24个HPS菌株进行PCR鉴定，扩增得到特异性条带，从分子生物学水平验证了HPS常规鉴定的准确性。并且采用ERIC-PCR指纹图谱分型和OMP分型技术对24个分离株进行分型，结果显示两种方法均表现出良好的多态性，两种方法的结果在本研究中也表现出一致性。本研究结果与Ruiz的研究结果有所不同[10]，而本研究结果表明各猪场HPS流行情况复杂，同一猪场存在多种基因型，并且不同猪场流行的基因型也不一致。ERIC-PCR分型技术已被国内外学者应用于HPS的分型鉴定及流行病学研究[4,11-12]，本研究也进一步证实了该结论。另外，本实验显示OMP与ERIC-PCR分型方法均表现出遗传变异多样性，表明HPS的ERIC-PCR指纹图谱和OMP图谱均能够反映HPS分离株的遗传相关性，因此OMP分型技术应用于该菌的分型是可行的。

本研究中两种分型方法结果均表明24个野外分离株共得到10种图谱，即10种菌株：J猪场2种、G猪场3种、S猪场有5种。各猪场HPS流行的复杂程度不一致，虽然在同时期感染发病，但流行菌株存在地域性差异，因此造成疫苗免疫效果的差异。在商品化疫苗无效的情况下，可以考虑使用本猪场的分离株制备疫苗，但一个猪场可能存在多种菌株，传统方法采用血清分型进行菌株的选择，但该方法耗时费力，并且临床上有约15%～41%的分离株不能以现有的血清分型方法进行鉴定。因此，在无标准分型血清或用标准分型血清无法正确分型的情况下，采用ERIC-PCR和OMP分型技术对野外分离株进行基因分型和表型分型鉴定，可以为HPS的免疫预防提供参考。如本研究J猪场虽然分离到8个菌株，但通过分析表明仅存在2种图谱，即2个基因型菌株，因此制备疫苗时只需考虑该两种菌株。

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