胡文霞，冯瑜菲，何丽丽，关玮琨，江馗语，师东方

(东北农业大学动物医学学院，黑龙江 哈尔滨 150030)

猪水肿病(Eedema disease of swine，ED)是由某些特定血清型产志贺样毒素大肠杆菌(STEC)引起的断奶仔猪的一种急性致死性传染病[1]，以眼睑、胃壁等处水肿、共济失调、惊厥和麻痹为特征[2]。研究表明，F18ab菌毛和志贺样毒素Ⅱ型变异体(Shigalike toxinⅡ variant，SLT-Ⅱe)是猪 ED大肠杆菌主要毒力因子[3]，致病菌以其菌毛粘附于猪小肠上皮细胞，在肠道内定居和增殖并产生SLT-Ⅱe侵入机体，导致感染猪出现水肿和神经症状[4]。

目前，应用灭活疫苗对仔猪进行免疫是预防该病的主要措施，但免疫效果并不理想，这可能与灭活疫苗在制备过程中造成抗原破坏或有效抗原量不足有关，而且不能发挥肠道黏膜免疫系统在抗感染过程中的免疫保护作用[5]。杨春柳等用SLT-Ⅱe编码基因突变菌株(O139/SLT-Ⅱe*/07)口服免疫小鼠，证实该基因突变菌株对小鼠安全，能诱导小鼠产生局部免疫、细胞免疫和体液免疫应答，显示出了该菌株作为口服疫苗的潜在价值[6]。本实验用该突变菌免疫断奶仔猪，为猪水肿病口服疫苗的研究提供更加直接的实验数据。

1 材料和方法

1.1 菌株、主要试剂及实验动物 猪ED大肠杆菌(C83684，O139；CMCC44498，O138)购自中国兽医药品监察所；猪ED大肠杆菌基因突变菌株(O139/SLT-Ⅱe*/07)由本实验室构建[7]；断奶仔猪购自哈尔滨郊区某猪场；HRP标记的兔抗猪IgG购自北京博奥森生物技术有限公司；Affinity Purified Coat anti-Pig IgA购自哈尔滨欧瑞德生物试剂公司；CaCl2和海藻酸钠购自国药集团；LB培养基购自全氏金生物有限公司；猪细胞因子IL-10、IL-4、INF-γ的ELISA检测试剂盒购自天根生化科技有限公司。

1.2 微胶囊的制备 取在LB培养基中活化至第3代的 O139/SLT-Ⅱe*/07 按 1∶1000接种 1000 mL LB培养基中震荡培养18 h，离心收集菌体(4000 r/min，15 min，4℃)，用2%无菌海藻酸钠重悬。将重悬物均匀滴入2%CaCl2溶液中固化 40 min，制备的微胶囊用。生理盐水清洗之后4℃无菌贮存[8-10]。

1.3 实验动物分组、免疫和检测样品采集 将35日龄健康断奶仔猪随机分成3组，每组3头，隔离饲养。实验1组口服包有突变菌株的微胶囊(6.27×1013cfu)[4]；实验2组口服突变菌株的菌液(6.27×1013cfu)；实验3组作为对照组，口服无菌的PBS。连续口服3 d，每天1次。分别于首免前、第3次免疫后第7 d、14 d、21 d、28 d采集仔猪粪便、前腔静脉血液并分离血清，于4℃保存，待检。

1.4 猪血清中特异性IgG的检测 将LB培养的无F18ab菌毛生长的大肠杆菌O139以1×107cfu/mL包被ELISA反应板；参照文献[11]方法提取SLT-ⅡeB蛋白，以1.0 μg/mL包被反应板；表达纯化SLT-ⅡeA蛋白，以1.0 μg/mL包被反应板；参照文献[2]方法，用SB培养基培养大肠杆菌O139，提取F18ab菌毛蛋白，以2.0 μg/mL包被反应板。

参照文献[6]用间接ELISA方法检测血清中特异性IgG。以1∶80稀释的各组猪血清样品为一抗，1∶4000稀释的HRP标记兔抗猪IgG为二抗，常规操作，反应终止后，测定OD450nm值。

1.5 猪粪便中特异性sIgA的测定 采用间接ELISA方法进行检测。取各组猪的粪便样品，每0.1 g粪便加入0.5 mL提取液，振荡30 min，12000 r/min、离心10 min，收集上清液。

参照文献[6]，分别以SLT-ⅡeA蛋白、SLT-ⅡeB蛋白、F18ab菌毛蛋白及LB培养的大肠杆菌O139为抗原包被ELISA反应板，以粪便处理上清液为一抗，1∶10000稀释的HRP标记的羊抗猪IgA为二抗，常规操作，终止反应后，测定OD450nm值。

1.6 猪血清中 IL-10、IL-4、INF-γ的测定 参照试剂盒使用说明书，取各组猪血清样品检测IL-10、IL-4、INF-γ的含量。

1.7 突变菌株的定植检测 参照文献[6]，将采集的各组猪粪便样品，用无菌生理盐水稀释后涂布于麦康凯(含萘啶酮酸50 μg/mL)琼脂平板上，37℃培养18 h。挑取萘啶酮酸抗性菌落，扩大培养后进行PCR检测。PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定后，对阳性PCR产物进行StuⅠ单酶切，0.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.8 攻毒保护试验 参照文献[12]的方法培养大肠杆菌O138，提取SLT-Ⅱe，-20℃保存备用。分别从实验1组和对照组各随机选择1头仔猪，耳静脉注射SLT-Ⅱe纯化蛋白6 ng/kg[12]，72 h内观察临床症状，72 h后剖检观察组织器官的病理变化并制做组织切片[13]。

2 结果

2.1 猪血清中特异性IgG的检测 经间接ELISA方法检测，各组检测数据取平均值(p<0.05)。实验1组仔猪于第3次免疫后第21 d，在其血清中检测到抗O139抗原的IgG抗体(P/N>2)(图1A)；在免疫后第14 d、21 d、28 d检测到抗F18ab菌毛蛋白的 IgG抗体(P/N>2)(图1B)；在免疫后的第 7 d检测到抗SLT-ⅡeA蛋白的 IgG抗体(P/N>2)(图 1C)；针对SLT-ⅡeB蛋白相应的IgG抗体水平变化不明显(图1D)。实验2组仔猪第3次免疫后21 d，血清中抗O139和SLT-ⅡeA的IgG抗体升高较明显(图1A和图1C)，而针对其他抗原的抗体水平变化无显著差异。

2.2 猪粪便中特异性sIgA的测定 经间接ELISA方法检测，各组检测数据取平均值(p<0.05)。实验1组仔猪于免疫后第7 d、21 d、28 d，在其粪便中检测到抗SLT-ⅡeA蛋白的sIgA抗体(P/N>2)(图2A)；免疫后第14 d、21 d检测到抗O139抗原的sIgA抗体(P/N>2)(图2B)；免疫后第7 d检测到抗SLT-ⅡeB蛋白的sIgA抗体(P/N>2)(图2C)；免疫后第14 d检测到抗F18ab菌毛蛋白的sIgA抗体(P/N>2)(图2D)。实验2组仔猪免疫后，粪便中sIgA抗体也有升高，免疫后的第14 d、21 d检测到了抗O139抗原的sIgA抗体(图2B)；免疫后第 7 d、28 d检测到抗SLT-ⅡeB蛋白的sIgA抗体(图2C)；但sIgA抗体水平均低于实验1组，并且抗体持续时间比较短。

图1 血清中特异性IgG抗体水平Fig.1 The level of specific IgG antibodies in serum

图2 粪便中特异性sIgA抗体水平Fig.2 The level of specific sIgA in faeces

2.3 猪血清中IL-4、IL-10、INF-γ 的检测 经检测，IL-4没有明显的变化(图3A)；第3次免疫后14 d IL-10达最高值(354.65 pg/mL)，比免疫前(219.95 pg/mL)有明显升高(图3B)；INF-γ含量也有升高，但幅度没有IL-10明显，含量为58.146 pg/mL～75.762 pg/mL(图 3C)。

图3 血清中细胞因子水平Fig.3 The level of cytokines in serum

2.4 突变菌株的定植检测 活性菌能否在肠道发挥作用，取决于能否在消化道环境中存活并定殖。只有在通过消化道后还保持大量活菌，并在肠道定殖，才能发挥生理作用[14]。第3次免疫后21 d，仍能从实验1组和实验2组猪的粪便样品中检出突变菌株，表明该突变菌株在猪的肠道内发生了定植。

2.5 攻毒保护试验

2.5.1 临床症状 攻毒后24 h内仔猪均厌食、喜卧，24 h后实验1组仔猪恢复饮水，进食。对照组仔猪萎靡不振、食欲消失，发热达41℃，卧地不起，但眼睑、头部无明显水肿表现和神经症状。

2.5.2 病理组织学变化 攻毒72 h后迫杀，剖检，可见对照组仔猪胃粘膜水肿、胆囊水肿、肝脏边缘有坏死灶、肺脏呈纤维素样病变；实验1组仔猪无可见病理变化。

对照组主要的病理组织学变化为浆液性变质性肝炎、浆液性纤维素性肺炎、浆液性胃壁炎(H.E染色)。胃壁固有层结构疏松，黏膜和肌层间有红色胶样水肿，黏膜下层增厚，黏膜下层结缔组织水肿、出血(图4A)。肺泡腔中可见脱落的泡壁上皮细胞和嗜中性白细胞。间质毛细血管扩张，充满红细胞，血管内皮细胞肿胀、脱落，血管腔内嗜中性白细胞聚积。间质水肿，有嗜中性白细胞浸润(图4C)。

图4 对照组和实验1组的组织切片(100×)Fig.4 Tissue section of control group and experimental groupⅠ(100×)

3 讨论

肠道黏膜的局部免疫是动物机体抵抗经消化道感染病原的第一道屏障，能否诱导肠道黏膜的局部免疫对预防消化道传染病具有重要的意义[7]。与灭活疫苗相比口服疫苗能够直接进入肠道并诱导产生局部免疫，同时避免因注射免疫对动物的应激和病原的散播。

本实验用毒力基因缺失大肠杆菌口服免疫断奶仔猪后，突变菌可在肠道内停留21 d，免疫仔猪产生了特异性IgG抗体和局部sIgA抗体，IFN-γ含量升高，对SLT-Ⅱe的攻击具有保护作用，说明该基因突变菌株诱导机体产生了特异性局部免疫、体液免疫和细胞免疫应答[15-16]，这一结果进一步表明该突变菌株可作为仔猪水肿病口服疫苗。尽管从实验1组和实验2组的样品中均检测到了特异性的IgG和sIgA，但实验1组的免疫效果优于实验2组，可能与进入肠道的活菌数量有直接关系。微胶囊可以保护口服免疫菌株免受胃液影响[17]，而直接口服无微胶囊保护的突变菌后，由于胃液的作用，到达肠道的活菌数量大大减少。微胶囊虽然对细菌有保护作用，但会增加疫苗的生产成本，能不能通过直接增加口服免疫剂量来增加到达肠道的细菌数量尚需进一步研究。

[1]Imberechts H,Greve H De,Lintermans P.The pathogenesis of edema disease in pigs.A review[J].Vet Microbiol,1992,31(2-3):221-233.

[2]Moxley R A.Edema disease[J].Vet Clin North Am Food Anim Pract,2000,16(1):175-185.

[3]MacLeod D L,Gyles C L,Wilcock B P.Reproduction of edema disease of swine with purified Shiga-like toxin-II variant[J].Vet Pathol,1991,28(1):66-73.

[4]Makino S,Watarai M,Tabuchi H,et al.Genetically modified Shiga toxin 2e(Stx2e)producing Escherichia coliis a vaccine candidate for porcine edema disease[J].Microb Pathog,2001,31(1):1-8.

[5]刘国平，吴斌，林艺远，等.大肠杆菌IIe株 SLT-ⅡeB与FedF基因融合表达及表达产物的免疫原性研究[J].微生物学报，2007，47(6)：1044-1049.

[6]杨春柳，许亚卓，师东方，等.BALB/c鼠口服免疫猪水肿病大肠杆菌基因突变菌株的免疫效果[J].中国预防兽医学报，2009，31(11)：878-881.

[7]付海兵，丁琳，杨春柳，等.猪水肿病大肠杆菌基因突变株的构建[J].中国预防兽医学报，2007，29(11)：830-835.

[8]王勇，解玉冰，马小军.壳聚糖/海藻酸钠生物微胶囊的研究进展[J].生物工程进展，1999，19(2)：13-16.

[9]Sultana K,Godward G,Reynolds N,et al.Encapsulation of probiotic bacteria with alginate-starch and evaluation of survival in simulated gastrointestinal conditions and in yoghurt[J].Int J Food Microbiol,2000,62(1-2):47-55.

[10]杨汝德，陈惠音，许燕滨.用微型包囊法研制新型高效微生态活菌制剂[J].广东药学院学报，2000，16(2)：87-90.

[11]丁琳，师东方，付海兵，等.志贺样毒素Ⅱ型变异体B亚单位单克隆抗体的制备[J].中国预防兽医学报，2009，31(3)：222-225.

[12]MacLeod D L,Gyles C L.Purification and characterization of an Escherichia coliShiga-like toxin II variant[J].Infect Immun,1990,58(5):1232-1239.

[13]满晓营.猪水肿病与仔猪副伤寒二价基因工程疫苗研究[D].武汉：华中农业大学图书馆，2009.

[14]徐致远.乳杆菌的肠道定殖和菌群调节作用研究[D].无锡：江南大学图书馆，2006.

[15]Yang H,Parkhouse R M.Phenotypic classification of porcine lymphocyte subpopulations in blood and lymphoid tissues[J].Immunology,1996,89(1):76-83.

[16]Winter H,Schmidt J,Ruttinger D,et al.Therapeutic T cells induce tumor-directed chemotaxis of innate immune cells through tumor-specific secretion of chemokines and stimulation of B16BL6 melanoma to secrete chemokines[J].J Transl Med,2007,5:56.

[17]杨春，阎容华，曾蔚，等.缓释伤寒荚膜多糖微球疫苗免疫动物的实验研究[J].生物医学工程学杂志，2003，20(4)：626-629.